豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的分離培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一類急性、高度接觸性傳染病，主要臨床癥狀為嘔吐、腹瀉、脫水性下痢。因PED對新生仔豬的高致死率，所以每次爆發(fā)都會對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。我國是主要發(fā)病國之一，自2010年起該病的發(fā)病率明顯升高，且規(guī)模更大。
　　由于近年來豬流行性腹瀉的頻繁爆發(fā)，使其成為世界范圍的豬傳染病。2013年5月美國首次報道豬流行性腹瀉案例，并且短時間內迅速擴散蔓延。同年，QiChen等成功分離

2、出美國傳播的兩株PEDV流行毒株。本實驗室近些年來致力于PEDV減毒活疫苗的研究工作，已經(jīng)取得了一定進展，相繼得到了不同類型的重組PEDV，但尚未進行過PEDV流行毒株的分離培養(yǎng)。本實驗嘗試以Vero細胞分離出PEDV-GJL野毒株，為今后PEDV的疫苗研發(fā)和相關基礎研究建立基礎。
　　纖突蛋白（S蛋白）在決定PEDV宿主噬性方面發(fā)揮重要作用，而編碼纖突蛋白的S基因突變率較高，S基因的分子流行病學研究在PEDV防控研究中發(fā)揮著越來

3、越重要的作用。本研究首先進行樣本中PEDV野毒株S基因的分段擴增和基因進化樹分析，然后借鑒QiChen等的培養(yǎng)方案，以期在Vero細胞上分離出臨床樣品中的PEDV-GJL野毒株。
　　基因進化樹分析結果顯示，樣品中兩野毒株與國內各地區(qū)近幾年的流行毒株在同一遺傳支系。隨后樣品中野毒株的分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)得到的毒株在Vero細胞上的CPE并非常見流行毒株的合胞體狀態(tài)，而是類似DR13毒株引起的病變形態(tài)。進一步做對比實驗顯示病毒的增殖不依賴外

4、界胰酶的存在，故懷疑毒株是DR13毒株。經(jīng)RT-PCR檢測ORF3序列，發(fā)現(xiàn)分離到的是PEDV-GJL和疑似DR13減毒疫苗株的混合毒株，并且病毒增殖傳至第四代時野毒株PEDV-GJL丟失。取第二代病毒進行兩次空斑純化實驗，分別挑取大、小不同蝕斑后得到的病毒經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)基因序列與弱毒DR13疫苗株高度同源。
　　由分離純化結果分析，豬場免疫過弱毒DR13疫苗，采集的臨床糞便樣品中攜帶有疫苗毒株。病毒接種后維持液中添加TPB和酵母粉是