急性白血病p53基因啟動子區(qū)域異常甲基化的研究.pdf

1、本文旨在觀察p53基因P1啟動子甲基化在急性白血病中的存在情況及其在ANLL與ALL中的異同，并結(jié)合臨床資料，探討p53基因甲基化檢測在急性白血病診療方面的意義。 材料與方法： 實驗對象包括急性單核細胞白血病U937細胞株；急性白血病初發(fā)或者復發(fā)以及慢性白血病急性變患者的骨髓或者外周血標本共3l例；健康體檢自愿者外周血標本共11例供對照。 1、U937細胞培養(yǎng)與標本收集 使用RPMI1640培養(yǎng)液(10﹪的小

2、牛血清)，37℃，5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。細胞處于對數(shù)生長期，細胞密度達1.0×10<'6>/mL時收獲細胞。 經(jīng)患者或者健康體健者同意，取骨髓或者外周血約2mL常規(guī)抗凝，分裝成500μL于EP管中-80℃保存標本。 2、DNA的提取與檢測 按美國Omega公司的E．Z．N．A Tissue DNA Kit提取試劑盒的步驟進行細胞或骨髓標本的DNA提取，獲得的DNA樣品分裝后放入-30℃冰箱保存?zhèn)溆谩＋@取的D

3、NA樣品在核酸蛋白分析儀上行濃度及純度的檢測。使用0.5﹪瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的完整性：將需要檢測的DNA樣品電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察DNA的質(zhì)量。 3、限制性內(nèi)切酶酶切消化 MspI、HpaII、EcoRII的反應體系均由1 μ g提取的基因組DNA與足夠量相應的限制性內(nèi)切酶及反應緩沖液等組成50μL的反應體系，37℃過夜酶切。BstN I的反應體系由1 μ g提取的基因組DNA與1μL限制性內(nèi)切酶及反應緩沖液

4、等組成50μL的反應體系，60℃過夜酶切。所有酶切后產(chǎn)物經(jīng)加熱滅活后行下一步實驗。 4、引物設計 (1)、p53基因的引物設計本論文研究的p53基因CCGG的甲基化位點位于883位(GenBank sequenceno.X54156)，CCWGG位于756，858，和940(GenBank sequence no．X54156)。p53基因擴增引物根據(jù)文獻資料，然后經(jīng)過Primer5.0軟件改進。最終設計引物如下：正義5

5、’GGCGGATTACTTGCCCTTAC 3’；反義5’AGCCCGTGA CTCAGAGAGGAC3’ (2)、內(nèi)參照β-actin基因的引物設計使用Primer 5.0軟件對β-actin基因(NCBI登錄號BC013835)進行酶切分析，先找出這四種限制性內(nèi)切酶(Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)均不能切開的序列。選取其中一段，然后對其進行引物設計。最終選擇Tm值與目的基因相近、產(chǎn)物與目的基因相差至少l

6、OObp的引物序列。正義為：5’GTCCACCGCAAATGCT TCTA 3’；反義：5’GC從TGCTATCACCTCCCCT 3’。 5、PCR擴增與產(chǎn)物鑒定 分別以酶切后產(chǎn)物(Msp Ⅰ、npa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)及基因組DNA為模板分別行目的片段及參照片段的PCR反應，產(chǎn)物電泳后在凝膠成像分析系統(tǒng)內(nèi)觀測電泳條帶及攝像；部分標本的電泳條帶經(jīng)凝膠回收純化后進行測序。 6、標本臨床資料的處理

7、 新收集的骨髓片或者血片經(jīng)瑞氏染色后鏡檢，經(jīng)確認為符合要求的標本后行進一步實驗；所有標本的骨髓細胞形態(tài)學診斷由各醫(yī)院的血液實驗室完成；病人的其余臨床資料通過病案室查取。 結(jié)果： 1、U937細胞的培養(yǎng)結(jié)果： 倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞生長密度達對數(shù)生長期；行細胞計數(shù)結(jié)果約為6×10<'6>/個mL。 2、DNA的檢測：所提取DNA標本經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測符合要求(純度：OD260/OD2801.7-2

8、.0)；提取的急性白血病患者基因組DNA直接電泳，結(jié)果無散在片段，表明無降解。 3、PCR擴增與產(chǎn)物鑒定結(jié)果：分別以酶切后產(chǎn)物(Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ、EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ)及基因組DNA為模板進行PCR擴增，Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ的酶切位點均為CCGG位點，但是Msp Ⅰ不受甲基化的影響，而Hpa Ⅱ受甲基化的影響，即如果CCGG位點存在甲基化，Msp Ⅰ酶切后產(chǎn)物為模板的PCR反應不能擴增出片段，而Hpa，Ⅱ酶切后產(chǎn)物

9、為模板的PCR反應即可以擴增出片段；如果CCGG位點不存在甲基化，則兩個反應均無擴增片段：同理，EcoR Ⅱ、BstN Ⅰ也是有相同的酶切位點CCWGG，結(jié)果分析同上。部分標本電泳后目的條帶經(jīng)凝膠回收后行產(chǎn)物測序，測序結(jié)果通過BLAST比對結(jié)果為符合要求擴增的片段：表明擴增產(chǎn)物即為所需擴增的p53基因的目的片段。 4、病例的臨床資料 通過查詢可能與急性白血病治療效果相關(guān)或者預后相關(guān)的信息，包括年齡、性別，診斷分型，流式細

10、胞學檢查結(jié)果，初診時患者白細胞計數(shù)、血紅蛋白、血小板計數(shù)；是否伴有感染、出血；是否伴有其他臟器疾?。皇欠裼懈纹⒘馨徒Y(jié)腫大的情況；2療程標準化療是否達到完全緩解等。 5、急性白血病患者p53基因甲基化檢測結(jié)果 急性白血病患者p53基因第一啟動子甲基化陽性率為38.7﹪，而急性淋巴細胞白血病與急性非淋巴細胞白血病患者分別為45.5﹪，35﹪。正常對照標本中未檢測到p53基因的異常甲基化。 p53基因甲基化情況在急性白

11、血病病人與正常人之間經(jīng)過Fisher精確概率檢驗，p=0.0183<0.05，表明差別有統(tǒng)計學意義，即病人與正常人之間甲基化陽性數(shù)不同。急性淋巴細胞白血病與急性非淋巴細胞白血病患者之間經(jīng)過Fisher。精確概率檢驗比較P=0.7054)0.05，差別無統(tǒng)計學意義，表明p53甲基化陽性率在ALL與ANLL之間無差別。 6、急性白血病患者p53基因甲基化與臨床的關(guān)系 分析急性白血病患者p53基因甲基化與患者年齡、外周血白細胞

12、計數(shù)、血紅蛋白、血小板、是否伴有出血、感染、肝脾淋巴結(jié)是否腫大等之間的關(guān)系。其中，p53基因異常甲基化與肝脾是否腫大之間的關(guān)系經(jīng)統(tǒng)計學計算P<0.05，表明有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1、部分急性白血病患者存在p53基因第一啟動子異常甲基化，正常對照中未檢測到p53基因的甲基化： 2、p53基因第一啟動子在急性淋巴細胞白血病與急性非淋巴細胞白血病均可發(fā)生異常甲基化，兩者之間發(fā)生甲基化的概率無統(tǒng)計學差異。 3、