以HCV NS3解旋酶為靶點(diǎn)的計(jì)算機(jī)模擬篩選的初探及其FRET熒光檢測法的建立.pdf

1、Hepatitis C VirusHCV病毒是一種單鏈RNA病毒,目前除干擾素和利巴韋林的聯(lián)合用藥外,尚無有效的治療手段.HCV NS3解旋酶解開病毒復(fù)制過程中形成的RNA雙鏈結(jié)構(gòu)讓復(fù)制過程得以繼續(xù),是病毒復(fù)制周期中的關(guān)鍵酶.為了加速尋找抗HCV藥物的過程,我們以HCV NS3解旋酶為靶點(diǎn),進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬篩選的探索.計(jì)算機(jī)模擬篩選是以計(jì)算機(jī)的方法模擬受體或靶點(diǎn)結(jié)構(gòu),對一定的數(shù)據(jù)源(樣品庫)進(jìn)行親和力評價(jià),能夠大大加速藥物發(fā)現(xiàn)的一種方法

2、.我們使用被學(xué)術(shù)界承認(rèn)的Accelrys公司的Insight Ⅱ 和Cerius 2 軟件平臺和SGI工作站,通過對HCVNS3解旋酶進(jìn)行蛋白建模,優(yōu)化,已知抑制劑分子對接驗(yàn)證等過程,以微生物天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(MNPD)為數(shù)據(jù)源對NS3解旋酶蛋白模型進(jìn)行了剛性篩選和柔性評價(jià),從2000個(gè)樣品中篩得5個(gè)打分較高的化合物.本工作得到了創(chuàng)騰科技(Neotrident Inc.)的大力幫助.為了進(jìn)一步對計(jì)算機(jī)模擬篩選的結(jié)果進(jìn)行生物活性驗(yàn)證,我們設(shè)

3、計(jì)了一種基于熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象的,適用于高通量篩選(High Through-put Screen,HTS)的NS3解旋酶活性的熒光檢測法.在本實(shí)驗(yàn)中,我們用麥芽糖親和層析介質(zhì)進(jìn)行純化了從重組的pMAL-c2載體中表達(dá)的NS3-4A蛋白.我們設(shè)計(jì)了NS3解旋酶的FRET底物,它是由兩條3'-和5'-端標(biāo)各記熒光供體(HEX)和熒光受體(TAMRA)的互補(bǔ)單鏈DNA形成的雙鏈DNA結(jié)構(gòu).在形成DNA雙鏈的同時(shí),鏈末端相互靠近的H