紫紺型先天性心臟病改變骨髓微環(huán)境代謝并誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　先天性心臟?。ㄏ刃牟。┦侨澜缡孜怀錾毕菁膊?，紫紺型占先心病的10％。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是心血管疾病再生醫(yī)學(xué)研究最常用的種子細(xì)胞。但BMSCs居住于相對低氧的骨髓微環(huán)境中，而紫紺先心病患兒長期慢性缺氧可能會進(jìn)一步加重骨髓微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，從而改變骨髓微環(huán)境的代謝，影響B(tài)MSCs的細(xì)胞生物學(xué)行為。本研究旨在通過代

2、謝組學(xué)技術(shù)研究紫紺先心病嚴(yán)重缺氧引起的骨髓微環(huán)境代謝改變及其對BMSCs細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討引起B(yǎng)MSCs細(xì)胞生物學(xué)行為改變的機(jī)制和體外矯正方法。
　　方法:
　　采用血?dú)夥治鲈u估紫紺和非紫紺患兒骨髓微環(huán)境的氧濃度并檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α，HIF-1α）表達(dá)。在體外常規(guī)培養(yǎng)下比較紫紺和非紫紺組BMSCs的增殖、多向分化和抗凋亡能力的差異。通過氣相色譜-飛行時間質(zhì)

3、譜聯(lián)用(GC-TOF/MS)技術(shù)分析紫紺患兒骨髓微環(huán)境的代謝改變，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖大量蓄積在紫紺組骨髓微環(huán)境中。體外培養(yǎng)添加D-半乳糖(D-Gal)模擬紫紺組骨髓微環(huán)境D-半乳糖蓄積以驗(yàn)證其對BMSCs生物學(xué)行為的影響。分析非紫紺、紫紺和D-Gal組BMSCs Notch1和細(xì)胞衰老相關(guān)通路蛋白的表達(dá)，并采用飛行時間質(zhì)譜方法檢測Notch1基因啟動子區(qū)的甲基化程度。最后在體外培養(yǎng)階段添加Notch受體激動劑Jagged-1多肽研究其能否逆

4、轉(zhuǎn)紫紺組BMSCs受損的增殖、分化和抗凋亡能力。
　　結(jié)果:
　　紫紺患兒骨髓微環(huán)境氧濃度為3.3％顯著低于非紫紺組6.5％的氧濃度（P＜0.01）而HIF-1α呈高表達(dá)。紫紺組BMSCs的增殖、多向分化和抗凋亡能力較非紫紺組均顯著下降。代謝組學(xué)結(jié)果提示紫紺患兒骨髓內(nèi)糖酵解和糖異生途徑加強(qiáng)，抑制三羧酸循環(huán)，并引起D-半乳糖大量蓄積。體外實(shí)驗(yàn)證明高劑量D-半乳糖可以阻斷BMSCs細(xì)胞周期，抑制BMSCs的增殖、分化和抗凋亡能力

5、，并上調(diào)β-半乳糖苷酶，表明D-半乳糖可以誘導(dǎo)BMSCs過早衰老。通過Western Blot分析發(fā)現(xiàn)紫紺和D-Gal組BMSCs Notch1、Id1、pRb表達(dá)受抑制，P16表達(dá)顯著增加，而P53和P21無明顯改變。通過飛行時間質(zhì)譜甲基化分析發(fā)現(xiàn)P3、P4和P5代紫紺組和D-Gal組BMSCs Notch1基因啟動子區(qū)GpG11.12.13、CpG24和CpG33三個位點(diǎn)甲基化程度顯著增高，且不隨細(xì)胞傳代的代數(shù)而下降，提示D-半乳糖

6、引起Notch1基因啟動子區(qū)高甲基化。體外培養(yǎng)添加Jagged-1能上調(diào)Notch1、Id1和pRb，抑制P16表達(dá)，并能有效改善紫紺組BMSCs的增殖、分化和抗凋亡能力。
　　結(jié)論:
　　紫紺型先心臟病引起骨髓微環(huán)境嚴(yán)重缺氧，導(dǎo)致骨髓微環(huán)境能量代謝方式改變和D-半乳糖蓄積。高濃度D-半乳糖引起Notch1基因啟動子區(qū)高甲基化，進(jìn)而抑制Notch通路活性，激活P16通路，引起B(yǎng)MSCs發(fā)生過早衰老，從而全面損害其增殖、分化和