轉(zhuǎn)抗蟲基因107楊和巨霸楊外源基因表達(dá)研究.pdf

1、隨著基因工程的發(fā)展，將某些生物中的抗性基因轉(zhuǎn)化到目的林木基因組中，從而改良林木性狀，提高林木的品質(zhì)，已得到廣泛應(yīng)用。為了明確多基因轉(zhuǎn)化載體中的基因互作及載體結(jié)構(gòu)對(duì)外源基因表達(dá)穩(wěn)定性和高效性的影響。本文選取轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因和Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107楊各三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，以及含有BtCry1Ac-BtCry3A基因，但表達(dá)框結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)基因巨霸楊各四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為試驗(yàn)對(duì)象，研究了各轉(zhuǎn)基因株系外源基

2、因的穩(wěn)定性、Bt毒蛋白的時(shí)空變化及轉(zhuǎn)基因?qū)?07楊光合的影響，同時(shí)確定了一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的外源基因在基因組中的插入位置。主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過(guò)PCR檢測(cè)表明，各轉(zhuǎn)基因株系均能擴(kuò)增出一條與含有目的基因的陽(yáng)性質(zhì)粒大小相同的條帶。說(shuō)明轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry A-NTHK1、和Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107楊各3個(gè)轉(zhuǎn)化株系中三個(gè)目的基因均穩(wěn)定存在，含有BtCry1Ac-BtCry3A基因的兩種基因轉(zhuǎn)化載體所轉(zhuǎn)化的8個(gè)

3、轉(zhuǎn)基因巨霸楊株系也均檢測(cè)到目的基因的穩(wěn)定存在。
　　2.通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)各個(gè)外源基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，Cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄豐度較低，轉(zhuǎn)錄豐度大小在2.9×103～7.2×104之間，Cry3A基因的轉(zhuǎn)錄豐度較高，為4.1×105～5.6×107。可見，外源基因可以在107楊和巨霸楊mRNA水平上正常表達(dá)。轉(zhuǎn)基因107楊和轉(zhuǎn)基因巨霸楊中，Cry3A基因轉(zhuǎn)錄豐度均明顯高于Cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄豐度。

4、>　　3.利用ELISA技術(shù)檢測(cè)了各轉(zhuǎn)基因株系不同月份枝條上部葉片Bt毒蛋白含量變化規(guī)律及8月份枝條上部、中部和下部三個(gè)部位葉片、韌皮部和木質(zhì)部的Bt毒蛋白含量，分別進(jìn)行比較，結(jié)果表明Cry1Ac和Cry3A毒蛋白表達(dá)量在各株系之間存在顯著差異，各株系Cry3A毒蛋白含量均極顯著高于Cry1Ac毒蛋白含量，后者表達(dá)量極低。各載體在不同月份Cry1Ac毒蛋白表達(dá)量規(guī)律為:p1和p2載體的各轉(zhuǎn)基因株系均在8月份達(dá)到頂峰，p1載體的毒蛋白表達(dá)

5、量大于p2，p3和p4載體各轉(zhuǎn)基因株系均在9月份達(dá)到頂峰，p4載體的毒蛋白表達(dá)量大于p3。Cry3A毒蛋白表達(dá)量均在8月份表達(dá)最高。各載體株系6、7月份毒蛋白的表達(dá)量上升比較緩慢，8、9月份其表達(dá)量急劇上升，而后呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。8月份枝條上部、中部和下部三個(gè)不同部位葉片、韌皮部和木質(zhì)部的Bt毒蛋白含量測(cè)定結(jié)果未表現(xiàn)出一致性。
　　4.對(duì)轉(zhuǎn)基因各株系的光合指標(biāo)進(jìn)行比較，分析全天各轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率、蒸騰速率均值和胞間二氧化碳

6、濃度差異性得出，各轉(zhuǎn)基因株系的各項(xiàng)光合生理指標(biāo)與對(duì)照相比，數(shù)值雖大小不同，但大部分株系均顯著高于對(duì)照或與對(duì)照無(wú)顯著差異，這說(shuō)明外源基因的導(dǎo)入沒(méi)有影響植株的光合能力。
　　5.采用Tail-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行外源基因插入位置檢測(cè)，經(jīng)過(guò)測(cè)序分析證明，轉(zhuǎn)Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107楊2號(hào)株系外源基因位于受體植物基因組第14條染色體上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)外源基因的插入使F-box蛋白結(jié)構(gòu)域受到影響。比對(duì)插入位點(diǎn)兩側(cè)堿基序列