南林895楊轉抗旱耐鹽基因研究.pdf

1、楊樹在我國分布廣泛，生長較快，適應性強，繁殖容易，并且其基因組小，在傳統(tǒng)和分子操作上要比大多數(shù)樹種簡單，是林木育種研究的模式樹種。DREBlC轉錄因子(Dehydration Responsive：Element Binding)是一類與逆境脅迫相關的轉錄因子，它能夠識別與干旱、高鹽及低溫等脅迫應答相關基因啟動子區(qū)域中的 DIE(dehydration responsiveelement)順式作用元件并與之結合，從而啟動下游抗逆基因的表

2、達，提高植物的抗逆性。開展楊樹抗干旱耐鹽堿轉DREBlC基因研究對于我國干旱、鹽堿地區(qū)的造林綠化、擴大楊樹的栽培區(qū)、改善生態(tài)環(huán)境等方面均具有重要的現(xiàn)實意義。 本研究以南林895楊 (美洲黑楊I-69×歐美楊I-45雜種F1中選育出的優(yōu)良無性系)為受體材料，采用農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導法轉化抗逆轉錄因子DREBlC基因；同時，同源克隆擬南芥逆境脅迫誘導性啟動子 rd29A，構建植物表達載體p

3、DI2-rd29A 并轉化楊樹，主要試驗結果如下： 1．根據(jù)NCBI上報道的rd29A啟動子序列設計引物，從擬南芥中同源克隆rd29A啟動子，構建植物表達載體pBrd，并轉化煙草進行活性驗證。轉基因煙草的GUS組織化學染色及PCR分析結果表明，在低溫、干旱及高鹽等脅迫誘導下，rd29A啟動子可增強GUS基因表達，表明rd29A啟動子可應用于植物抗逆基因工程研究。 2．構建由逆境脅迫誘導型啟動子rd29A啟動目的基因DRE

4、BlC表達的植物表達載體pDR2-rd29A，雙酶切鑒定結果表明，rd29A啟動子成功地插入載體pDR2 中；采用液氮凍融法將載體 pDR2-rd29A 導入農桿菌LB4404中，菌液PCR擴增出目的條帶，證明該植物表達載體pDR2-rd29A 已轉入農桿菌LB4404中。 3．進行選擇性抗生素潮霉素的敏感性試驗，分別對葉片分化及生根本底濃度進行敏感性試驗，結果表明，3mg/L 潮霉素(Hyg)可作為芽再生的臨界篩選濃度；1.5

5、mg/L Hyg可作為芽生根的篩選濃度。 4．用農桿菌介導法將由兩種啟動子(組成型啟動子35S 和逆境脅迫誘導型啟動子rd29A)啟動的目的基因DREBlC 導入南林895楊中。經過潮霉素篩選，得到潮霉素抗性的轉35S::DREBlC 基因的楊樹80株，轉rd29A::DREBlC 基因的楊樹40株?？剐灾仓甑腜CR與實時定量PCR分子檢測結果，轉35S::DREBlC基因楊樹有30株呈陽性，轉rd29A::DREBlC 基因楊