日本血吸蟲組成型高表達HSPs生物信息學分析及Sjp40的RNA干擾效應探索.pdf

1、血吸蟲病流行廣泛，危害嚴重。但由于其生活史的復雜性以及血吸蟲在宿主體內發(fā)展了較強的免疫逃避機制等，目前尚沒有可用于臨床或現(xiàn)場的具有穩(wěn)定的良好保護力的疫苗。血吸蟲與宿主相互關系的分子機制亦待進一步研究。調控、自穩(wěn)、自適應是生命體的本來屬性，血吸蟲依賴自身應激反應機制在面對各種脅迫因子及宿主機體防御攻擊而維持自身穩(wěn)定發(fā)育成熟，在這一過程中熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)應發(fā)揮著重要的作用。HSPs在許多生物體細

2、胞進程和應激處理過程中作用關鍵，熱休克反應是一種普遍的穩(wěn)態(tài)機制，保護細胞和整個生物體面對環(huán)境壓力的有害影響。有研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲在紫外致弱處理條件下，HSP70呈現(xiàn)顯著上調趨勢，而HSP90、HSP60呈現(xiàn)下調。血吸蟲HSPs超家族內的協(xié)同效應及其機制，值得深入探討。
　　Sjp40是日本血吸蟲主要蟲卵抗原，呈現(xiàn)組成型表達，具有潛在的早期診斷價值。研究闡明曼氏血吸蟲主要蟲卵抗原P40(SmP40)隸屬于具有α晶體蛋白結構域的小熱休

3、克蛋白sHSP20家族。sHSP(12000-43000)是HSPs超家族的重要成員，與細胞抗凋亡及生物體應激反應密切相關。這些HSPs基因在日本血吸蟲抗脅迫維自穩(wěn)中應扮演了重要的角色。本研究對HSPs進行生物信息學分析并通過浸泡法轉染dsRNA進行RNA干擾以沉默日本血吸蟲sHSP-Sjp40基因，探究其干涉效應及其對其他組成型高表達SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的協(xié)同效應。
　　一、日本血吸蟲組成型高表達H

4、SPs生物信息學分析及克隆表達鑒定
　　目的：生物信息學分析日本血吸蟲HSPs超家族中組成型高表達Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因，并進行克隆、表達、鑒定。
　　方法：
　　1.通過相關文獻檢索日本血吸蟲轉錄組、蛋白質組數(shù)據(jù)庫SjTPdb等找尋日本血吸蟲組成型高表達HSPs基因。
　　2.通過BLAST服務平臺及MEGA4.0軟件對Sjp40基因結構域及同源性進行分析，并構建進化樹。

5、
　　3.通過ExPASy服務器中的ProtParam工具、SMART程序、Tmpred程序、PSORT程序等對SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90、Sjp40基因編碼蛋白序列進行分析。
　　4.以DNAMAN選取HSPs基因全長編碼區(qū)域設計含酶切位點的引物擴增，得到純化后的產(chǎn)物克隆到pET-32a(+)載體中，構建原核表達載體質粒，IPTG誘導表達，對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。
　　5.以抗Sjp4

6、0單抗6F10通過Western blot檢測pET-32a(+)-Sjp40重組蛋白免疫反應性。
　　結果：
　　1.sHSP-SJCHGC06324/AY814158.1、HSP60-SJCHGC09129/AY813151.1、HSP70-SJCHGC06292/EZ000074、HSP90-SJCHGC00820/AY815927.1在日本血吸蟲生活史各期轉錄組、蛋白質組中呈現(xiàn)高豐度組成型高表達情況。
　　2.

7、Sjp40隸屬于具有α晶體蛋白結構域的小熱休克蛋白sHSP20家族，同時檢索已報道的曼氏血吸蟲和日本血吸蟲基因組、轉錄組、蛋白質組研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)P40家族合計有39條高度同源均具有α晶體蛋白結構域的基因，其中具有完整讀碼框的cDNA有19條，并且Sjp40與SJCHGC06324蛋白序列高度同源。
　　3.SjHSP60蛋白序列和SjHSP70蛋白序列二級結構主要以α螺旋為主;SjHSP90蛋白序列和Sjp40蛋白序列二級結構主要以

8、無規(guī)則卷曲為主，而SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因編碼蛋白均是跨膜蛋白，四種HSPs含有多個修飾位點及潛在的抗原表位。
　　4.原核表達載體質粒轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導后在大腸埃希菌中表達了重組蛋白。
　　5.重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-Sjp40以融合蛋白形式可溶性表達重組蛋白，Western blot顯示重組蛋白具有良好的免疫反應性。
　　結論：

9、　　日本血吸蟲生活史各期轉錄組、蛋白質組中有四種HSPs基因呈現(xiàn)高豐度、組成型、高表達狀況。日本血吸蟲主要蟲卵抗原Sjp40隸屬于小熱休克蛋白家族，并且Sjp40與SJCHGC06324高度同源。SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因編碼蛋白均是跨膜蛋白，并且含有多個修飾位點及潛在的抗原表位。Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因克隆到pET-32a(+)載體中獲得誘導表達，抗Sjp40單抗6F10可

10、識別重組表達的Sjp40。
　　二、日本血吸蟲小熱休克蛋白Sjp40的RNA干擾效應探索
　　目的：研究日本血吸蟲小熱休克蛋白(sHSP)Sjp40基因的RNA干擾（RNAi）效應及其干擾后日本血吸蟲HSP60、HSP70、HSP90基因在mRNA水平出現(xiàn)的協(xié)同效應，觀察各期蟲體Sjp40、SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA表達水平。
　　方法：
　　1.設計兩端含T7啟動子PCR引物從尾

11、蚴cDNA文庫中擴增Sjp40基因和陰性對照GFP基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后通過RNAi試劑盒體外轉錄直接純化合成dsRNA。
　　2.日本血吸蟲尾蚴（湖南株）自陽性釘螺逸出，經(jīng)腹部感染新西蘭兔和BALB/c小鼠。并用蓋玻片粘取液面尾蚴，機械斷尾獲取童蟲。新西蘭兔及小鼠于感染后42～45d剖殺，經(jīng)門靜脈灌注收集成蟲，并收集蟲卵。尾蚴、成蟲及蟲卵經(jīng)PBS洗滌后備用。
　　3.將獲取的成蟲用PBS(pH7.4)沖洗3次以上后轉入

12、RPMI1640培養(yǎng)基中（含10mM Hepes，10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素），置5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。
　　4.通過浸泡法轉染20μg/ml、50μg/ml、80μg/ml dsSjp40及dsGFP，同時設立空白對照組。5％CO237℃培養(yǎng)7天后收集處理組及對照組成蟲，PBS洗滌3次后備用。
　　5.按TRIzol試劑說明書提取日本血吸蟲尾蚴、成蟲、蟲卵及干擾后成蟲總RNA，DNa

13、seⅠ消化，逆轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR檢測Sjp40基因及SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因mRNA的表達。
　　6.按TRIzol試劑使用說明提取成蟲可溶性總蛋白(total soluble protein，TSP)。Western blot檢測dsRNA處理后蛋白表達情況。
　　7.統(tǒng)計學處理，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)中計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，用析因設計資料的方差

14、分析方法進行檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義，顯著性水準α=0.05，雙側。
　　結果：
　　1.Sjp40基因在第3d、5d、7d培養(yǎng)過程中其mRNA表達水平變化無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.以空白對照組為基線，與其相比不同RNAi劑量轉染后Sjp40 dsRNA轉染組中Sjp40基因的轉錄水平變化有顯著性差異(F=24.301，P=0.001)，下降了80％以上，而GFPdsRNA轉染組中Sjp40

15、基因轉錄水平變化無顯著性差異(P＞0.05);蛋白質水平較空白對照及陰性對照組(dsGFP)出現(xiàn)明顯降低，qPCR結果顯示在dsSjp40 RNAi后SjHSP60、SjHSP70、SjHSP90基因的mRNA表達水平變化無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.轉染后Sjp40 dsRNA轉染組在相對分子量55000-70000處出現(xiàn)高表達的蛋白條帶，是否是由于協(xié)同效應引起，有待進一步研究。
　　4.Sjp40、SjHSP6