西瑪津對兩棲類發(fā)育影響的分子生物學研究.pdf

1、西瑪津（Simazine，2-Chloro-4，6-bis Ethylamino-1，3，5-Triazine）是一種在農(nóng)業(yè)，園藝和休閑場所廣泛應用的三嗪除草劑。該除草劑從1955被研發(fā)上市。西瑪津能夠通過化學、光催化或者生物過程進行降解。降解研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)西瑪津在土壤和水中的半衰期在幾天和150天間變化。溫度和濕度能夠影響西瑪津的半衰期，低溫和干燥能夠延長降解時間。2009年，美國環(huán)?？偩骤b于西瑪津的多重暴露途徑和高生產(chǎn)量，將其列入內(nèi)分

2、泌干擾物篩選計劃(EDSP)。在中國，西瑪津也是一種在地下水和地表水中經(jīng)常被檢測到的除草劑。
　　內(nèi)分泌干擾物是指由能夠干擾天然荷爾蒙的合成、分泌、運輸、結合、活性的外源物質，從而導致有關體內(nèi)平衡、生殖、發(fā)育和行為的異常。研究顯示，西瑪津屬于內(nèi)分泌干擾物(EDCs)，在體外的抗雄激素篩選實驗中西瑪津表現(xiàn)出了刺激效應;在動物實驗中，西瑪津對多個物種的生長、發(fā)育、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)都產(chǎn)生了不利影響，包括對哺乳類和兩棲類的生殖系統(tǒng)毒性。<

3、br>　　西瑪津由于其在土壤和水中的高殘留，在美國、歐洲和澳大利亞的地表水和地下水中是經(jīng)常被檢測到的第二類物質，在我國河流和出廠水中也時常被檢測到。西瑪津在地表水和地下水中的濃度因為會受到季節(jié)和被調(diào)查地區(qū)使用以西瑪津為基本成分的除草劑的范圍的影響，所以是可變的。在美國西瑪津在地表水中的濃度可以高達1300μg/L，在地下水中高達800μg/L。根據(jù)WHO的水純凈標準，自來水中西瑪津的濃度達到2μg/L時便被認為是污染水。所以，本研究將西

4、瑪津的濃度設為0.1、1、10和100μg/L，該濃度梯度包括了從低到高多個西瑪津的環(huán)境相關濃度，確保高濃度的西瑪津能夠對實驗動物產(chǎn)生發(fā)育毒性，以便進一步的對其毒性作用機制進行研究。
　　兩棲類具有復雜的生活周期和滲透性的皮膚，能通過多路徑暴露于陸地和水體中的環(huán)境污染物，這些特性使他們成為一種檢測內(nèi)分泌干擾物暴露和相關作用的理想的模式生物。同時，環(huán)境污染是導致近年來全球兩棲類數(shù)量大量減少的主要原因。兩棲類成為當今世界上生存形式最為

5、嚴峻的群體。因此，為了保證兩棲類的種群延續(xù)和生態(tài)健康，從多水平研究內(nèi)分泌干擾物對兩棲類生長發(fā)育的影響已成為必然。本論文的目的是在研究西瑪津對中華大蟾蜍和非洲爪蟾的生長發(fā)育產(chǎn)生陽性有害影響的前提下，對其相關聯(lián)的分子水平的改變進行研究。
　　本研究分別以本地種兩棲動物中華大蟾蜍和模式種兩棲動物非洲爪蟾為動物模型，研究西瑪津對這兩個物種生長發(fā)育的影響、以及西瑪津對非洲爪蟾的肝臟相關基因（vtga2、ar、er、gr、hsp70、hsp9

6、0）表達水平和雄性性腺組織的雜交微陣列芯片表達譜的影響。通過基因表達的性能分析來探索介導外源雌激素對非洲爪蟾不利影響的分子路徑和細胞過程。初步推測西瑪津對兩棲類發(fā)育毒性的信號通路和作用機制，為在分子水平的進一步研究提供理論基礎。
　　中華大蟾蜍暴露西瑪津的實驗設0.01％ DMSO對照組和4個西瑪津染毒組(0.1、1、10和100μg/L)。每個劑量組隨機挑選發(fā)育到第25/26期的正常蝌蚪144只蝌蚪，平均放入8個25×20×20

7、 cm3的平行缸中暴露85d。在暴露期間，每天記錄動物的生長發(fā)育情況、死亡數(shù)、變態(tài)情況;染毒結束后，進行性腺的組織病理學切片的制作和觀察;對中華大蟾蜍的一般生長發(fā)育指標的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。結果顯示，10和100μgL西瑪津導致中華大蟾蜍蝌蚪死亡率顯著升高(p＜0.01，分別是對照組的2.17和2.86倍）;西瑪津對中華大蟾蜍的一般生長情況（體重、體長）無顯著性影響(p＞0.05);在各時間點對非洲爪蟾蝌蚪前腿發(fā)生的百分比無顯著性的抑制(

8、p＞0.05)，但10和100μg/L西瑪津使中華大蟾蜍蝌蚪后腿的伸展時間顯著延長，與對照組相比分別延長了2.1％(p＜0.05)和6.9％(p＜0.01);西瑪津抑制了中華大蟾蜍蝌蚪變態(tài)，各暴露組在實驗結束時皆有少數(shù)處于38-40期的發(fā)育異常個體;西瑪津導致中華大蟾蜍卵巢組織的卵細胞溶解、壞死，形成空泡，生殖細胞減少，睪丸組織中出現(xiàn)睪丸卵母細胞;西瑪津暴露組中出現(xiàn)了發(fā)育顯著遲緩無法辨認性別的性腺;暴露組的中華大蟾蜍性別比與對照組的相比

9、未見顯著差異(p＞0.05);西瑪津暴露各組中均未見異常性腺形態(tài)。
　　非洲爪蟾暴露西瑪津的實驗也設0.01％ DMSO對照組和4個西瑪津染毒組（0.1、1、10和100μg/L）。每個劑量組隨機挑選發(fā)育至46/47階段的健康蝌蚪120只，平均放入8個25×20×20 cm3的平行缸中暴露100 d。在暴露期間，每天記錄動物的生長發(fā)育情況、死亡數(shù)和變態(tài)情況。染毒結束后，制作非洲爪蟾性腺和肝臟的組織病理學切片并鏡下觀察;對爪蟾的一般

10、生長發(fā)育指標的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理;采用Q-RT-PCR對雌雄爪蟾肝臟相關基因表達量進行檢測;在100μg/L西瑪津暴露組雄性非洲爪蟾的生殖系統(tǒng)生理學和毒理學終點具有顯著性改變的基礎上，采用非洲爪蟾全基因組芯片(Agilent Xenopus4x44K Gene ExpressionMicroarrays)對雄性非洲爪蟾性腺組織進行基因表達譜研究。根據(jù)差異基因的功能角色和FC值，從結果中選取15個關鍵基因，采用Q-RT-PCR方法對表達譜數(shù)

11、據(jù)進行驗證。然后，采用生物信息學技術GO分析和pathway分析對復雜的差異表達基因數(shù)據(jù)進行處理轉換。尋求改變的生理學和毒理學終點與基因表達改變的關聯(lián)性。
　　西瑪津對非洲爪蟾具有明顯的發(fā)育毒性。10和100μg/L西瑪津導致非洲爪蟾的死亡率皆比對照組顯著升高64.3％(p＜0.05)。西瑪津對非洲爪蟾的體重和體長沒有影響(p＞0.05)。10和100μg/L西瑪津使雄性非洲爪蟾的睪丸重量和GSI與對照組相比皆顯著下降57.1％(

12、p＜0.05)。雌性爪蟾的卵巢重量和GSI未受影響(p＞0.05);西瑪津沒有影響非洲爪蟾卵巢組織結構的發(fā)育，但對睪丸組織結構的影響顯而易見。暴露各組的睪丸切片中出現(xiàn)了不規(guī)則排列的曲細精管、腫脹的精原細胞和大量的空腔結構。100μg/L組尤為顯著，出現(xiàn)精原細胞腫脹、部分曲細精管出現(xiàn)固縮和壞死、核濃染和片狀結構;暴露各組的睪丸組織中出現(xiàn)沿著頭尾軸不連續(xù)發(fā)育的異常節(jié)段;西瑪津沒有誘導非洲爪蟾產(chǎn)生性別比異常。分別統(tǒng)計暴露期的第60、70、80

13、和90 d西瑪津暴露各組中完全變態(tài)的非洲爪蟾數(shù)量，結果發(fā)現(xiàn)，在60和70 d時，西瑪津對非洲爪蟾蝌蚪的變態(tài)百分比無有顯著性的抑制(p＞0.05)，10μg/L西瑪津暴露組蝌蚪在第80d的時間點完全變態(tài)百分數(shù)顯著低于對照組8.1％(p＜0.05)，第90 d的時間點爪蟾完全變態(tài)百分數(shù)與對照組的相比差異更顯著(p＜0.01，低于22.2％);100μg/L西瑪津暴露組蝌蚪在第80天和90 d的時間點完全變態(tài)百分數(shù)皆分別顯著低于對照組13.5

14、％和21.8％(p＜0.01)。同時，10和100μg/L西瑪津也顯著的延長了蝌蚪完全變態(tài)所需要的天數(shù)(p＜0.01)。西瑪津暴露各組的雌雄爪蟾肝臟重量和HSI與對照組相比無顯著差異(p＞0.05)，但各暴露組雄性爪蟾的HSI出現(xiàn)了小于雌性的趨勢;10和100μg/L西瑪津導致肝臟組織出現(xiàn)溶解、壞死，肝臟細胞萎縮。只有0.1μg/L西瑪津顯著誘導了雌性爪蟾肝臟中的hsp70的表達(p＜0.05)，肝臟組織中的vtga2、hsp90、ar

15、、er、gr基因表達量未被顯著影響。
　　篩選出對非洲爪蟾生殖發(fā)育影響最大的西瑪津濃度是100μg/L，且作為內(nèi)分泌干擾物西瑪津對雄性非洲爪蟾的影響大于雌性，由此，選擇雄性非洲爪蟾作為分子實驗部分的動物模型。全基因組芯片結果顯示，在100μg/L西瑪津暴露組的睪丸組織中共有1315個差異基因，其中上調(diào)基因454個，下調(diào)基因861個(FC＞=2且p＜=0.05)。芯片的原始數(shù)據(jù)已上傳到NCBI Gene Expression Omn

16、ibus，序列號為17214940;采用Q-RT-PCR方法對選取基因進行驗證的結果與表達譜結果一致;差異表達基因的GO分析結果顯示，與生物過程相關的有188個注釋條目，與細胞組成相關的有37個注釋條目，與分子功能相關的有33個注釋條目;通過差異基因的pathway分析，本次實驗篩選出5條顯著性富集差異基因的通路，分別是精氨酸和脯氨酸代謝通路、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸代謝通路、核黃素代謝通路、細胞周期通路、色氨酸代謝通路。
　　本

17、研究確認了西瑪津對兩棲類中華大蟾蜍和非洲爪蟾的發(fā)育毒性。高劑量的西瑪津增加了兩棲類的死亡率，降低了GSI，對性腺和肝臟的組織結構產(chǎn)生損傷，延遲或抑制了兩棲類的變態(tài)，從兩種兩棲動物的毒理學數(shù)據(jù)比較來看，中華大蟾蜍對西瑪津更加敏感;西瑪津對非洲爪蟾肝臟組織基因表達的無影響，可能是由于長期暴露導致機體的調(diào)節(jié)適應，抑或與肝細胞損傷有關;詳細研究了與非洲爪蟾生理學和毒理學終點改變相關聯(lián)的分子水平的變化。差異基因分析結果暗示，西瑪津對雄性非洲爪蟾不

18、是通過誘導芳化酶表達實現(xiàn)雌激素效應的。同時，也未干擾雌激素受體和雄激素受體信號通路。生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中的差異基因42Sp50，Zpax，wees，acps，ptgs2,th，stc1與西瑪津導致的雄性非洲爪蟾的生殖毒性效應密切相關。綜合分析推測，西瑪津主要通過干擾與類固醇分泌相關的基因的表達，從而引起身體的組織發(fā)育和生理功能異常。西瑪津對雄性非洲爪蟾的毒性作用模式很有可能是一種綜合的新陳代謝調(diào)節(jié)模式?？傊?，本研究確認了西瑪津對本地種

19、中華大蟾蜍和模式動物非洲爪蟾的發(fā)育影響，以及參與雄性非洲爪蟾生殖系統(tǒng)生理學和毒理學終點改變的眾多基因和信號通路，為進一步研究西瑪津生殖毒性的分子作用機理提供數(shù)據(jù)支持。使我們能夠通過西瑪津對兩棲類生殖發(fā)育的影響，預知和推測其對人類生殖發(fā)育的危害。對制定西瑪津在我國環(huán)境中殘留的安全標準、建立環(huán)境監(jiān)測方法和發(fā)育毒性的預防策略都有著很高的科學參考價值，最終為建立和完善具有中國特色，并與國際接軌的環(huán)境雌激素安全標準化技術體系和數(shù)據(jù)庫奠定堅實的基礎