組蛋白H3K9二甲基化參與斑馬魚神經(jīng)丘發(fā)育和毛細胞再生.pdf

1、噪聲、耳毒性藥物和衰老等因素導致人類內耳機械能感受細胞毛細胞的損傷和缺失，是導致獲得性感音神經(jīng)性耳聾的主要原因。和低等的脊椎動物如魚類、禽類不同，哺乳類動物毛細胞損傷缺失后不能夠自發(fā)性再生，將導致不可逆的聽力損失。因此毛細胞再生調控成為了治療感音神經(jīng)性耳聾的終極靶標。但是由于內耳毛細胞深埋于頭顱顳骨中，標本獲取和處理困難較大，并且不易直接觀察，為毛細胞發(fā)育和再生調控研究帶來了困難。
　　側線是位于魚類體表感知水流和壓力變化的機械感

2、受器，它是由一組相對獨立的神經(jīng)丘組成，位于神經(jīng)丘中央的機械感受器毛細胞以及位于周邊的非感覺支持細胞構成神經(jīng)丘的基本結構。側線毛細胞如內耳毛細胞一樣來自始基，具有相似的發(fā)育和分化立體模式、相似的的結構以及功能調控機制，由于斑馬魚側線器位于體表，便于活體觀察毛細胞，成為了研究毛細胞再生的經(jīng)典模型。但在不同的發(fā)育時期毛細胞再生可能受到側線器毛細胞發(fā)育及自我修復的影響，因此研究不同發(fā)育時期毛細胞再生能力及規(guī)律非常重要。
　　機械感受器的發(fā)

3、生（如內耳器官發(fā)生、神經(jīng)丘發(fā)育）涉及到細胞增殖、細胞凋亡和分化過程，需要嚴格的時間和空間調控以產(chǎn)生相互作用的特定數(shù)目、分布和分化狀態(tài)的細胞。在此過程中特定基因的有序表達和功能調控具有重要的意義，因此以可遺傳的基因表達調控信息傳遞為主要研究內容的表觀遺傳學成為了器官發(fā)生研究的熱點問題。
　　“組蛋白密碼”是其重要部分，核小體組蛋白上的共價修飾，在真核細胞的染色質結構重塑和基因表達調控方面起重要作用。組蛋白甲基化作為一個關鍵調節(jié)因素，

4、被認為在基因表達的抑制或者活化、以及染色體結構域中發(fā)揮了關鍵作用。
　　研究表明，在細胞核內，組蛋白甲基化和去甲基化過程處于動態(tài)平衡，兩過程分別由組蛋白甲基轉移酶和組蛋白去甲基化酶催化。常染色質組蛋白單-，雙-甲基化主要由組蛋白甲基轉移酶(HMTase)催化，組蛋白甲基轉移酶G9a主要作用于H3K9的單-、雙-甲基化。
　　有研究顯示G9a調控的H3K9甲基化是細胞分化的必要條件。G9a缺陷小鼠胚胎及其胚胎干細胞中甲基化H3

5、K9急劇下降，其研究結果表明G9a調節(jié)常染色體H3 K9的甲基化，其為早期胚胎發(fā)育所必需且參與發(fā)育相關基因的轉錄抑制。在小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞早期分化中，H3K9me2的可以檢測到，但出生后消失，提示H3K9me2參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的發(fā)育。H3K9me2在內耳發(fā)育及毛細胞再生過程中是否發(fā)揮生理作用目前尚不清楚，我們以斑馬魚側線器為模型，研究H3K9me2與毛細胞發(fā)生、發(fā)育及再生的關系。
　　第一部分斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞發(fā)育實驗模型的

6、建立
　　目的：
　　建立研究斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞發(fā)育的實驗模型，定量研究神經(jīng)丘發(fā)育過程中細胞增殖及毛細胞分化過程，為神經(jīng)丘毛細胞發(fā)育機制研究提供實驗模型。
　　材料和方法：
　　選擇野生型AB品系斑馬魚，在3dpf-7dpf的發(fā)育過程中以活細胞染料FM1-43FX以及MyosinⅥ標記毛細胞，BrdU標記增殖細胞，觀察神經(jīng)丘的增殖及毛細胞的分化過程。合成地高辛標記fgfr1，atoh1a的反義RNA探針，進行斑馬

7、魚全標本包埋的RNA原位雜交，研究fgfr1和atoh1a mRNA在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的表達情況。
　　結果：
　　1.3dpf～7dpf斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞發(fā)育分化的關鍵時期:以FM1-43FX標記的毛細胞在幼魚孵育出來前已出現(xiàn)，隨著時間推移，毛細胞數(shù)目逐漸增加。3dpf為4.100±0.2049(n=6),4dpf為5.386±0.1809(n=14),5dpf為8.467±0.3528(n=6)，7dpf為9.225±0

8、.4061(n=8)。Student's t-test統(tǒng)計學分析結果:3dpf vs4dpf，P值=0.0006;4dpf vs5dpf，P值＜0.0001，差異具有顯著性。5dpf vs7dpf，P值=0.2017，差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.3dpf～7dpf斑馬魚神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細胞繼續(xù)增加:BrdU陽性標記見于神經(jīng)丘周邊區(qū)支持細胞細胞核，毛細胞細胞核陽性標記少見。5dpf神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細胞數(shù)目2.300±0.3222

9、(n=6)，7dpf神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細胞4.333±0.4244(n=6)。統(tǒng)計學分析結果顯示P=0.0003，二者差異有顯著性。
　　3.fgfr1、atoh1a在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的表達:FGFR mRNA在神經(jīng)丘的發(fā)育
　　過程中表達，證實FGF信號通路參與神經(jīng)丘的發(fā)育;側線器毛細胞前體細胞在分化為毛細胞時表達atoh1a，我們的研究顯示5dpf斑馬魚神經(jīng)丘中atoh1amRNA表達于神經(jīng)丘中央?yún)^(qū)，7dpf時atoh1

10、a表達降至低水平。由于神經(jīng)丘毛細胞此后繼續(xù)再生，atoh1a陽性毛細胞前體細胞仍將繼續(xù)存在，進一步證實了atoh1a參與毛細胞分化及再生的過程。
　　結論：
　　1.成功建立了研究斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞發(fā)育實驗模型;
　　2.建立斑馬魚全標本包埋的RNA原位雜交實驗方法;
　　3.定量研究了發(fā)育過程中神經(jīng)丘前體細胞增殖和毛細胞分化，為后期實驗提供數(shù)據(jù)基礎。
　　第二部分斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞再生實驗研究
　　

11、目的：
　　定量研究在不同發(fā)育階段神經(jīng)丘毛細胞再生能力，觀察最佳的研究神經(jīng)丘毛細胞再生的時間窗，建立斑馬魚神經(jīng)丘毛細胞再生實驗模型。
　　材料和方法：
　　選擇野生型AB品系斑馬魚，以活細胞染料FM1-43FX以及MyosinⅥ標記毛細胞，BrdU標記增殖細胞。新霉素處理3dpf，5dpf，7dpf斑馬魚，觀察損傷后即刻、24小時、48小時、72小時毛細胞損傷及恢復情況;合成地高辛標記c-mycb，odc1的反義RNA

12、探針，進行斑馬魚全標本包埋的RNA原位雜交，研究c-mycb，odc1 mRNA在新霉素處理1小時后神經(jīng)丘中的表達情況。
　　結果：
　　1.細胞凋亡是新霉素介導的神經(jīng)丘毛細胞死亡的主要方式:以FM1-43FX活體染料（紅色）標記毛細胞后，予新霉素處理1小時后固定觀察——位于神經(jīng)丘中央?yún)^(qū)向心性聚集的毛細胞消失，神經(jīng)丘外周區(qū)域可見多個散在的紅色質膜包繞的圓形固縮小核——凋亡小體，提示細胞凋亡是新霉素介導的神經(jīng)丘毛細胞死亡的主要

13、方式。
　　2.不同發(fā)育階段神經(jīng)丘新霉素損傷后毛細胞再生的規(guī)律:3dpf斑馬魚新霉素損傷后24小時毛細胞數(shù)目4.250±0.1794(n=12)，5dpf斑馬魚新霉素損傷后24小時毛細胞數(shù)目2.507±0.1433(n=15)，7dpf斑馬魚新霉素損傷后24小時毛細胞數(shù)目1.333±0.1491(n=9);5dpf斑馬魚新霉素損傷后24小時，48小時，72小時毛細胞數(shù)目分別為2.507±0.1433(n=15)，3.900±0.2

14、878(n=8)，9.378±0.3307(n=9)，損傷后72小時毛細胞數(shù)目達正常對照組87.5％。
　　3.新霉素損傷后神經(jīng)丘細胞增殖狀態(tài):斑馬魚神經(jīng)丘在新霉素損傷后，BrdU陽性細胞數(shù)目增多，但多位于外周支持細胞，新生毛細胞中少見。損傷后72小時FM1-43FX與BrdU共標細胞占毛細胞總數(shù)的24.94％±3.75％。
　　4.c-mycb和odc1 mRNA在新霉素損傷后神經(jīng)丘中的表達:新霉素損傷后毛細胞再生機制啟動

15、，研究結果顯示c-mycb及其下游靶向odc-1在神經(jīng)丘表達，且二者分布類似。
　　結論：
　　1.系統(tǒng)研究了神經(jīng)丘發(fā)育不同階段毛細胞再生的規(guī)律，選擇5dpf斑馬魚進行毛細胞再生研究，可剔除毛細胞繼續(xù)發(fā)育的干擾，是研究毛細胞再生的最佳時間窗。
　　2.損傷后毛細胞的恢復多為直接轉分化而來，部分新生毛細胞源于細胞增殖再生。
　　3.c-mycb和odc1 mRNA在新霉素處理后神經(jīng)丘表達，提示兩者參與新霉素介導的毛

16、細胞損傷后的修復過程，以及抗凋亡保護作用。
　　第三部分 H3K9me2在正常神經(jīng)丘發(fā)育過程中的作用
　　目的：
　　定量研究斑馬魚神經(jīng)丘發(fā)育過程中H3K9me2的表達，探索H3K9me2在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的作用。
　　材料和方法：
　　1.分別取3dpf，4dpf，5dpf，7dpf野生型斑馬魚作以下3標免疫熒光染色:
　　(1) FM1-43FX標記毛細胞
　　(2) anti-H3K9me

17、2
　　(3) DAPI
　　2.新霉素損傷后恢復72hrs后，作以下3標免疫熒光染色:
　　(1) FM1-43FX標記毛細胞
　　(2) anti-H3K9me2
　　(3) DAPI
　　結果：
　　1.神經(jīng)丘發(fā)育成熟過程中H3K9me2表達水平逐漸降低:H3K9me2在3dpf表達于神經(jīng)丘大部分細胞的細胞核中，4dpf隨著神經(jīng)丘毛細胞分化增多，H3K9me2僅散在表達于神經(jīng)丘外圍細胞;毛

18、細胞分化過程中H3K9me2降低，毛細胞發(fā)育成熟后逐漸消失(7dpf)。不同發(fā)育階段的斑馬魚神經(jīng)丘中H3K9me2(+)細胞與FM1-43FX(+)細胞的比值3dpf:1.830±0.09815(n=4);4dpf:1.195±0.03175(n=4);5dpf:1.060±0.1097(n=4);7dpf:0.6250±0.04907(n=4)。統(tǒng)計學分析結果顯示:3dpf vs4dpf，P值=0.0008;4dpf vs5dpf，P

19、值=0.2819;5dpf vs7dpf，P值=0.0111。3dpf和4dpf，5dpf和7dpf比值的差異有統(tǒng)計學意義。
　　2.新霉素損傷后神經(jīng)丘H3K9me2表達增加:新霉素損傷后72小時神經(jīng)丘毛細胞已基本恢復，花結形成，其外周亦可見較多H3K9me2陽性細胞。H3K9me2(+)細胞與FM1-43FX(+)細胞的比值1.153±0.07204(n=4)，與7dpf正常對照組0.6250±0.04907(n=4)相比，P值