溶酶體膜蛋白TMEM192在肝癌細胞HEPG2中的作用及其機制研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上第5大常見癌癥，占原發(fā)性肝癌的90％。在我國，HCC是最為常見的惡性腫瘤之一，其相關(guān)死亡率排名第二，僅次于肺癌。導(dǎo)致肝癌的高危環(huán)境因素主要是HBV和HCV病毒感染。在世界范圍內(nèi)因此原因而導(dǎo)致肝癌的占到肝癌發(fā)病總數(shù)80％之多。當然這其中還包括其他的病毒感染。近年來有研究報道，吸煙和酗酒也是肝癌的高危因素，并且在一些分子病中其患病的風險大大提升，比如血色素病，wils

2、on病等。
　　 自噬是細胞的代謝方式之一，是指在饑餓條件下，細胞通過蛋白的降解，使細胞質(zhì)中的物質(zhì)和細胞器得以循環(huán)利用。有研究結(jié)果表明，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而自噬在腫瘤細胞中也起著或者促進細胞死亡或者維持細胞存活的作用。自噬是如何發(fā)揮這些作用的目前也還不清楚。本研究以新的溶酶體膜蛋白TMEM192為切入點，從基因?qū)用嫜芯科鋵Ω伟┘毎臓顟B(tài)、信號通路、標志物的影響，進一步推測其可能的作用機制。期待可以發(fā)現(xiàn)肝癌預(yù)防和治療的

3、新的突破點。
　　 第一部分，TMEM192生物信息學(xué)分析和內(nèi)源性分布及亞細胞定位
　　 目的:
　　 在本部分，我們首先通過較全面的生物信息學(xué)分析來對TMEM192的氨基酸序列進行了分析，對它的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，并在此基礎(chǔ)上推測其可能具有的功能。并利用多種方法和證據(jù)進一步明確TMEM192是位于溶酶體的膜蛋白。同時對它的組織特異性分布進行研究。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用可以連接國際互聯(lián)網(wǎng)的電子計

4、算機。從NCBI查獲的人類TMEM192及鼠源Tmem192的全長氨基酸片段序列，并在專業(yè)的網(wǎng)站上對該基因進行結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。
　　 2.免疫熒光染色:為了證實TMEM192的亞細胞定位，分別利用溶酶體標志蛋白LAMP1(lysosomeassociatedmembraneprotein1)抗體，與特異性anti-TMEM192抗體對爬片細胞進行雙染色標記。將單層爬片生長的細胞先于固定液中固定，接著孵育一抗，再孵育連接熒光的二抗，

5、在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
　　 3.實時熒光定量PCR反應(yīng):在TRIzol提取總RNA后，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBRGreen(I)實時定量PCR方法檢測各個組織TMEM192的組織分布情況，以及在各個細胞株的表達。擴增產(chǎn)物的特異性通過熔解曲線和凝膠電泳雙重確認，采用2-△△ct法計算相對表達量。以上實驗須重復(fù)三次。
　　 4.Westernboltting分析:提取組織內(nèi)的蛋白后進行定量分析，然后經(jīng)過電泳

6、，轉(zhuǎn)膜，以及免疫雜交，最后發(fā)光顯影，進行結(jié)果分析。
　　 5.RT-PCR:檢測各個組織及各細胞系的TMEM192表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.TMEM192的生物信息學(xué)分析
　　 (1)通過查找TMEM192的基因序列并做生物的信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)人類TMEM192基因定位于第4號染色體(165，997，256-166，034，071)，編碼區(qū)全長4516堿基，含有6個外顯子，編碼271個氨基酸的蛋白

7、質(zhì)，分子量30KDa。其氨基酸序列如圖1-1A所示。小鼠Tmem192基因定位于8號染色體(67，471，084-67，492，933)，編碼區(qū)全長1123堿基，含有4個外顯子，編碼266個氨基酸序列的蛋白質(zhì)，分子量約30KDa(圖1-1B)。通過NCBI的BLAST比對工具比對發(fā)現(xiàn)人源和鼠源的蛋白質(zhì)序列具有高度的一致性，相似性達95％。
　　 (2)由信號肽分析軟件分析可知，該蛋白質(zhì)存在信號肽的可能性較小。由在線軟件分析可知(

8、如下所示)，TMEM192的疏水性較強，最大值達到3.000，且位于N端最小值為-2.500(圖1-4)。通常疏水性強的蛋白質(zhì)常分布于內(nèi)膜系統(tǒng)，胞內(nèi)水溶性較低，提示具有較重要的生物學(xué)作用。
　　 (3)由分析結(jié)果得知，TMEM192含有6個蛋白激酶磷酸化位點，TMEM192至少存在2個N末端的糖基化位點。TMEM192至少存4個以上的跨膜螺旋序列(H表示)，這表明可能是膜上的受體或者定位于膜上。
　　 2.免疫熒光染色:

9、綠色熒光顯示的區(qū)域為TMEM192抗體標記。TMEM192顯示為小點狀綠色信號，分布于細胞漿內(nèi)核周區(qū)域。膜上和核區(qū)域未見有綠色熒光信號。這表明TMEM192定位于細胞質(zhì)中。與anti-LAMP1共染色(紅色熒光部分)，我們發(fā)現(xiàn)TMEM192與LAMP1共定位特征，呈現(xiàn)雙通道融合后的橘黃色信號特征。
　　 3.實時熒光定量PCR:為了研究TMEM192的組織分布特性，我們以小鼠的組織為研究對象，觀察TMEM192在小鼠組織的表達特

10、性。通過定量PCR分析表明TMEM192mRNA在小鼠心、腎、肝及胰腺組織有較高的表達。而在其它組織如皮膚、脾臟、脂肪、小腸等組織及器官，TMEM192的mRNA表達量相對較低或甚少。
　　 4.Wesrenblotting:用商業(yè)化的抗TMEM192多克隆抗體，我們通過對上述組織的蛋白提取物進行Westernblotting分析，得到了較好的結(jié)果，TMEM192蛋白在肝臟、心臟、腎臟等臟器及組織具有高豐度的表達，而在皮膚、睪丸

11、及肺臟等器官和組織其蛋白質(zhì)豐度相對較低或缺乏。
　　 5.RT-PCR:在觀察TMEM192的組織學(xué)分布時我們也發(fā)現(xiàn)了TMEM192相對于正常細胞，在腫瘤細胞的高表達，我們利用普通RT-PCR技術(shù)，重復(fù)的觀察到了這一結(jié)果。
　　 結(jié)論:
　　 (1)TMEM192存在于人類基因定位于第4號染色體的一個高度保守的基因，含有2個N末端的糖基化位點，6個蛋白激酶磷酸化位點，4個以上的跨膜螺旋序列的一個膜蛋白。
　

12、　 (2)TMEM192是一個酶體膜蛋白，他和溶酶體標志蛋白LAMP1具有共定位特稈。
　　 (3)實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，TMEM192在小鼠心、腎、肝及胰腺組織有較高的表達。而在其它組織如皮膚、脾臟、脂肪、小腸等組織及器官，TMEM192的mRNA表達量相對較低或甚少。
　　 (4)Westernblotting分析發(fā)現(xiàn)TMEM192蛋白在肝臟、心臟、腎臟等臟器及組織具有高豐度的表達，而在皮膚、睪丸及肺臟等器官和組

13、織其蛋白質(zhì)豐度相對較低或缺乏。
　　 (5)TMEM192相對于正常細胞，在腫瘤細胞高表達。
　　 第二部分，TMEM192在肝癌細胞HepG2中的作用及其機制
　　 目的:
　　 在本部分研究中，我們進行了p-CMV-C-TMEM192-flag真核表達載體的構(gòu)建，觀察其在HepG2細胞中過表達對細胞生長和增殖的影響。同時利用RNA干擾技術(shù)把TMEM192-siRNA成功轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，達到沉默T

14、MEM192的表達后，進而分析TMEM192缺失后對腫瘤細胞系和正常細胞系的影響。
　　 方法:
　　 (1)將TMEM192逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)產(chǎn)物克隆入真核表達載體pCMV-C-Flag，經(jīng)酶切、PCR鑒定及測序分析，構(gòu)建pCMV-C-TMEM192-Flag真核表達載體。
　　 (2)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒pCMV-C-TMEM192-FlagDNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，熒光顯微鏡觀察其表達

15、。
　　 (3)在HepG2細胞中過表達后觀察對其生長和增值的影響。
　　 (4)利用RNA干擾技術(shù)將針對人TMEM192基因設(shè)計的siRNA序列用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HepG2細胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。MTT法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測HepG2細胞的凋亡，以及westernblot分析各相關(guān)基因的蛋白表達。
　　 (5)利用ATG7-siRNA誘導(dǎo)ATG7沉默后觀察，在HepG2細胞阻斷自噬

16、途徑是否能影響TMEM192-siRNA誘導(dǎo)的凋亡。進而推測TMEM192在這一過程中的可能的作用機制。
　　 結(jié)果:
　　 (1)重組真核表達載體pCMV-C-TMEM192-Flag已成功載入TMEM192的全長編碼基因(除終止密碼子外)，序列測定的結(jié)果與預(yù)期設(shè)計完全一致。外源性表達載體構(gòu)建成功。
　　 (2)熒光顯微鏡下可見在轉(zhuǎn)染pCMV-C-TMEM192-flag融合基因的HepG2細胞中存在熒光分布，

17、轉(zhuǎn)染成功。
　　 (3)在HepG2細胞中過表達TMEM192后，對于HepG2細胞的生長和增值并無顯著的影響。
　　 (4)TMEM192-siRNA轉(zhuǎn)染入HepG2細胞中，發(fā)現(xiàn)TMEM192基因表達沉默后，LC3的鏈接磷酸化被激活，同時Bax，caspase-3的表達升高，p38-MAPK磷酸化而激活。
　　 (5)在對HepG2細胞進行持續(xù)的TMEM192-siRNA干擾后，接著通過自吞噬的關(guān)鍵基因ATG7

18、-siRNA處理細胞，沉默ATG7表達后發(fā)現(xiàn)能明顯抑制在HepG2細胞的凋亡。并且在此過程中，我們也一并觀察到Caspase-12、Bax及Caspase-3蛋白同時受到明顯抑制。
　　 結(jié)論:
　　 (1)成功構(gòu)建了真核表達載體pCMV-C-TMEM192-Flag。
　　 (2)pCMV-C-TMEM192-Flag轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，過表達TMEM192后對細胞并無顯著的影響。
　　 (3)TME