布魯氏菌的分型鑒定及其SOD蛋白的原核表達(dá)和多抗制備.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人畜共患的全身性傳染病。布魯氏菌的宿主范圍主要包括家畜、野生動(dòng)物和人等,該病的臨床癥狀為長(zhǎng)期發(fā)熱、多汗、流產(chǎn)與不育、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等。布魯氏菌病的廣泛流行,給世界各國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)該病也給廣大一線獸醫(yī)和養(yǎng)殖者的健康帶來了嚴(yán)重的威脅,因此了解該病的致病機(jī)制,做好該病的預(yù)防和監(jiān)測(cè)工作是事關(guān)重要的。
　　本實(shí)驗(yàn)通過PCR(polymera

2、se chain reaction)分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)16SrDNA、omp2b基因、Cu/Zn-SOD基因、omp28基因、omp10基因、omp25基因、virB10基因等的應(yīng)用來對(duì)病料進(jìn)行分離鑒定,又通過布魯氏菌的分型方法AMOS–PCR對(duì)其進(jìn)行分型。結(jié)果表明通過PCR方法檢測(cè)的53份病料中,有50份檢測(cè)結(jié)果為陰性,3份為陽(yáng)性,檢出率為5.66％,且經(jīng)分型后發(fā)現(xiàn)2份為牛種布魯氏菌,1份為羊種布魯氏菌;而通過細(xì)菌分離培養(yǎng)的方法只分

3、離到2份為陽(yáng)性,檢出率為3.77%;PCR方法比細(xì)菌分離方法的檢出率高出1.89個(gè)百分點(diǎn),細(xì)菌分離法和PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率為100%。
　　為分析布魯氏菌相關(guān)蛋白的免疫原性,本實(shí)驗(yàn)又以B.abortus疫苗株104M為模板,通過PCR方法擴(kuò)增Cu/Zn-SOD基因和omp28基因,并將其克隆至pGEX-4T-1(+)和pET32a載體進(jìn)行蛋白的重組表達(dá)和純化。
　　經(jīng)一系列活性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),重組的pGEX-SOD蛋白與牛

4、源布魯氏菌陽(yáng)性血清具有良好的反應(yīng)性。以重組pGEX-SOD蛋白為包被抗原進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其能區(qū)分布魯氏菌的陰性和陽(yáng)性血清。將重組pGEX-SOD蛋白免疫BABL/C小鼠制備多克隆抗體,純化制備出不含雜質(zhì)的多抗。構(gòu)建真核表達(dá)載體PCI-neo-SOD,提取超純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,IFA檢測(cè)所制備多抗與轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞具有一定的反應(yīng)性。
　　實(shí)驗(yàn)表明布魯氏菌的Cu/Zn-SOD等基因可以作為布魯氏菌病的檢測(cè)基因使用,而且重組的