P19細胞移植和神經(jīng)生長因子局部注射防治大鼠神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮實驗研究.pdf

1、目的：周圍運動神經(jīng)損傷以后，骨骼肌由于喪失了支配神經(jīng)的營養(yǎng)性作用，加之神經(jīng)再生速度緩慢，在神經(jīng)再分布之前，骨骼肌往往已發(fā)生嚴重的萎縮，故而嚴重影響肢體運動功能的恢復。積極探討運動神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮的治療措施無疑具有重要的意義。近年來的研究表明，來源于C3H/He雄性小鼠畸胎瘤的P19細胞具有多種分化潛能，其在特定誘導條件下可以分化為神經(jīng)組織。本實驗通過建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，采用將特定誘導條件下向神經(jīng)方向分化的P19細胞進行神經(jīng)損傷

2、遠端局部移植、神經(jīng)生長因子局部注射以及兩者結合的方法，對防治神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮的療效進行比較與評價。 方法：（1）P19細胞的體外誘導分化：P19細胞用含有1×10<'-6>M維甲酸(retinoid acid，RA)的10％FBS/αMEM培養(yǎng)液成團培養(yǎng)4天待用。部分成團培養(yǎng)的細胞經(jīng)0.5％胰蛋白酶-5.3mmol/L EDTA消化后在N2無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12天，觀察細胞形態(tài)變化。（2）P19細胞移植和神經(jīng)生長因子局部注

3、射防治神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮的實驗研究：取96只SD大鼠隨機分為坐骨神經(jīng)切斷組(A組)以及坐骨神經(jīng)切斷后神經(jīng)外膜縫合組(B組)，各組再分四小組：P19細胞移植組(1×10<'6>個/ml，術中及術后每兩周移植一次)、神經(jīng)生長因子注射組(5μg/ml，術中以及術后一個月每日注射)、P19細胞移植聯(lián)合神經(jīng)生長因子注射組和陰性對照組，分術后4周、8周兩個時相點檢測坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)、腓腸肌肌濕重恢復率、P19細胞的存活情況評估、骨骼肌光

4、鏡觀察及測定肌纖維橫截面平均Feret直徑，每小組6只。雙盲法采集實驗數(shù)據(jù)并用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，變量以均數(shù)士標準差(mean±SD)表示，采用隨機單位組設計資料的三因素方差分析(three-way-ANOVA)，以p<0.05表示有統(tǒng)計學意義。 結果：（1） P19細胞的誘導分化：經(jīng)RA誘導后P19細胞開始停止分裂，不貼壁而自動聚成細胞團樣生長。當將經(jīng)RA誘導4天的P19細胞消化后繼續(xù)作單層培養(yǎng)，一些細胞逐漸轉變?yōu)?/p>

5、類似于神經(jīng)元的形態(tài)，并開始長出1至2個突起，經(jīng)單層培養(yǎng)至第6天，大多數(shù)細胞轉變?yōu)轭愃朴谏窠?jīng)元的形態(tài)，神經(jīng)元樣細胞長出的突起逐漸增多并延長，形成稀疏的網(wǎng)絡樣結構，培養(yǎng)的神經(jīng)元樣細胞以橢圓形的雙極者為多見。（2） P19細胞移植和神經(jīng)生長因子局部注射防治大鼠神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮實驗研究：SFI測定結果、腓腸肌肌濕重恢復率測定結果以及肌纖維平均Feret直徑測量結果均提示術后8周的療效高于4周，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)；同樣三種

6、測量方法也提示，B組的治療效果較A組有顯著提高(p<0.01)；SFI測定結果顯示，所采取的四種不同治療方案組內均數(shù)無顯著性差異(p>0.05)，而腓腸肌肌濕重恢復率測定結果以及肌纖維平均Feret直徑測量結果均提示四種不同治療方案組內均數(shù)有顯著性差異(p<0.01)，其中NGF組與聯(lián)合組的肌濕重回復率均顯著高于空白組與P19細胞移植組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。骨骼肌光鏡觀察：術后4周，各組肌纖維細胞均發(fā)生了不同程度的萎

7、縮，橫截面均變小，邊界模糊，肌細胞形態(tài)欠規(guī)則，大小不一，間質中纖維組織增生明顯，肌細胞中孔海姆區(qū)模糊，消失。肌纖維萎縮程度以A組較為嚴重。術后8周，A組的肌纖維萎縮仍然嚴重，與4周比較未見明顯的改變，但是，B組肌纖維的萎縮情況均略有好轉，其中，在NGF組與聯(lián)合組可見部分恢復的肌細胞孔海姆區(qū)。P19細胞的存活情況評估：術后4周與8周的連續(xù)切片均未發(fā)現(xiàn)有存活的細胞。 結論：(1) 體外經(jīng)RA成團誘導培養(yǎng)的P19細胞可向神經(jīng)元方向分化