β-TcP-pluronicF-127復合支架結(jié)合BMSCs修復兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、第一部分：凋亡相關(guān)基因在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達及意義
　　目的:研究骨關(guān)節(jié)炎中細胞凋亡情況，凋亡相關(guān)基因(FAS、BCL-2、caspases3)等在骨關(guān)節(jié)炎中的表達及意義，從而在一定程度闡明骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理。
　　方法:通過Hulth法建立兔關(guān)節(jié)炎模型取得軟骨標本，免疫組化S-P法檢測凋亡相關(guān)基因(FAS、BCL-2、caspases3)在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中的表達情況，TUNEL法檢測骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡情況，并探討凋

2、亡相關(guān)基因(FAS、BCL-2、caspases3)的表達與軟骨細胞凋亡程度之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:術(shù)后8周時關(guān)節(jié)軟骨呈現(xiàn)典型的0A病理特征。實驗組和對照組關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡指數(shù)的差異具有顯著性(P<0.05);在軟骨細胞中FAS蛋白表達實驗組陽性率高于對照組，差異具有顯著性(P<0.05);實驗組關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細胞凋亡程度與FAS蛋白的表達呈正相關(guān)，差異具有顯著性(P<0.05)；在關(guān)節(jié)軟骨細胞中bcl-2蛋白的表達實驗組陽性率

3、低于對照組，但差異沒有顯著性(P>0.05);實驗組關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細胞凋亡程度與bcl-2蛋白的表達呈負相關(guān)，差異具有顯著性(P<0.05);caspase-3在實驗組的軟骨細胞陽性率高于對照組，差異具有顯著性(P<0.01);實驗組關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細胞凋亡程度與caspase3的表達呈正相關(guān)，差異具有顯著性(p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Hulth法可制作較好的骨關(guān)節(jié)炎動物模型。
　　2.關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡明顯

4、增加可能是關(guān)節(jié)炎形成的重要原因之一。
　　3.骨關(guān)節(jié)炎中FAS,BCL-2,caspase3等凋亡相關(guān)基因的表達與細胞凋亡程度具有明顯相關(guān)性，表明表達其與骨關(guān)節(jié)炎有密切關(guān)系。
　　第二部分兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外誘導分化
　　目的:探索兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外誘導分化的方法，研究其體外增殖，分化能力。探討其作為骨組織工程種子細胞的可行性和應用價值。
　　方法:采用密度梯度離心與

5、全骨髓培養(yǎng)結(jié)合的方法分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞，體外培養(yǎng);以流式細胞儀檢測BMSCs的表面抗原表達;在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并繪制生長曲線;分別體外誘導第3代細胞向軟骨細胞和骨細胞分化，對誘導分化為骨細胞進行堿性磷酸酶染色、VonKossa染色和I型膠原和骨鈣素免疫組化染色檢測鑒定，對誘導分化為軟骨細胞進行甲苯胺藍染色、番紅O染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測鑒定。
　　結(jié)果:經(jīng)密度梯度離心結(jié)合全骨髓培養(yǎng)法分離所得到的細胞形態(tài)均一

6、，呈長梭形或紡錘形。BMSCs增殖能力活躍,流式細胞儀檢測BMSCs顯示CD105,CD44,表達陽性，CD34和CD45表達為陰性。成骨誘導培養(yǎng)后，可見堿性磷酸酶染色、VonKossa染色、I型膠原和骨鈣素免疫組化染色陽性;向軟骨細胞誘導分化后，細胞甲苯胺藍染色、番紅0染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色為陽性。
　　結(jié)論:密度梯度分離法與全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合能理想的分離、純化BMSCs;BMSCs在體外具有良好的增殖潛能，BMSCs在誘導劑

7、作用下能表現(xiàn)出成骨細胞和軟骨細胞生物學特性，是組織工程理想的種子細胞。
　　第三部分BMscs/β-TcP/pluronicF-127復合支架修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究
　　目的:研究β-TcP/pluronicF-127復合支架結(jié)合BMSCs修復兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的效果，探討β-TcP/pluronicF-127復合支架做為組織工程支架承載BMSCs修復骨軟骨缺損的可行性。
　　方法:分離培養(yǎng)兔自體MSCs，將36

8、只健康新西蘭大白兔并隨機分為三組(A組、B組、C組)，于股骨髁關(guān)節(jié)面制備關(guān)節(jié)軟骨缺損模型(每孔直徑5mm、深度4-5mm)。A組、B組關(guān)節(jié)缺損處分別植入BMscs/β-TcP/pluronicF-127.、BMscs/β-TcP復合支架，C組為空白組不作處理。術(shù)后3、6個月分別取材，進行缺損區(qū)組織學、組織化學和免疫組織化學分析。A組、B組和正常關(guān)節(jié)標本進行生物力學測試。
　　結(jié)果:A組能形成豐富的透明軟骨樣修復組織，與周圍組織整合

9、良好;B組以不成熟透明軟骨;C組無修復組織?？偟男迯托Ч鸄組最理想，C組最差。生物力學測試得出:B組和 C組標本的蠕變時間和應力松弛時候較正常關(guān)節(jié)均縮短，楊氏模量較正常關(guān)節(jié)偏小，但差異均無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:BMSCs是良好的組織工程種子細胞，β-TcP/pluronicF-127復合支架是良好的生物工程支架,能承載BMSCs至缺損區(qū)修復骨軟骨缺損缺損，修復效果理想。BMscs/β-TcP/pluronicF-127復合支架材