熒光假單胞菌蛋白酶水解牛乳特性及免疫功能研究.pdf

1、為了初步探索熒光假單胞菌蛋白酶(Pseudomonas Fluorescens Protease，PFP)水解牛乳的特性以及水解物的免疫活性，先就PFP對牛乳中主要蛋白質的水解特性進行了試驗研究，確定了水解的最佳條件，并在此基礎上，進一步研究了牛乳的PFP水解物對小鼠免疫功能的影響。本試驗研究包括以下三個部分：
　　 1.PFP酶學性質的初步研究：對PFP的含量、活性、酶的最適溫度及pH值進行了研究。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(So

2、dium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)確定了經過鹽析、超濾、離子交換層析、疏水層析和凝膠層析后的蛋白酶達到了電泳純；通過考馬斯亮藍法測定酶的含量；通過偶氮酪蛋白法測定酶的活性及酶的最佳溫度與pH值。結果表明：得到的PFP為電泳純蛋白酶；酶的含量為62.37μg/mL；酶的活性為17333U/mL，酶的最佳溫度為40℃，最佳pH值為7.5。
　

3、　 2.PFP水解牛乳蛋白特性的研究：就PFP對牛乳中主要六種蛋白質的水解特性進行了試驗研究，確定了形成免疫活性肽的最佳條件。PFP水解牛乳中六種蛋白質后形成的水解物分別用SDS-PAGE和反相高效液相色譜(Reverse phase-highperformance liquid chromatograph，RP-HPLC)法檢測，通過正交試驗優(yōu)化了水解工藝參數。結果表明：αs-CN、β-CN、κ-CN均在PFP作用下得以水解，而BS

4、A、α-1a、β-1g三種乳清蛋白均未被水解。以RP-HPLC方法對PFP水解酪蛋白形成的免疫活性肽的測定，在通過210nm處檢測最大吸收峰面積得出最佳水解工藝參數：水解時間為3h、水解pH6.5、水解溫度40℃、蛋白酶與底物濃度比為1:200(v/v)。
　　 3.PFP水解脫脂乳粉產物免疫活性的研究：試驗研究了脫脂乳粉的PFP水解物對小鼠免疫功能的影響。受試小鼠分別灌喂生理鹽水、低劑量(100mg/Kg.bw)及高劑量(25

5、0mg/Kg.bw)PFP水解脫脂乳粉形成的水解產物，30d后測定小鼠免疫活性指標，就水解物對小鼠免疫功能的影響進行了試驗研究。結果顯示：高、低劑量飼喂對小鼠生長均無顯著影響；低劑量飼喂可增強脾臟指數(P<0.05)，而對胸腺指數影響不明顯；高劑量飼喂可增強單核巨噬細胞吞噬功能(P<0.05)；低劑量飼喂24h及高劑量飼喂48h均顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(P<0.05)，而低劑量飼喂48h及高劑量飼喂24h小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應及抗體細胞

6、生成能力均有極顯著的增強作用(P<0.01)；表明脫脂乳粉的PFP水解物可以提高小鼠免疫功能。
　　 通過完成三個部分的試驗研究，可以得出PFP是一種對熱有一定的耐受性的蛋白酶，該蛋白酶可水解牛乳中的酪蛋白，但不水解乳清蛋白，且水解物均含有免疫活性肽。PFP對酪蛋白酶解形成免疫活性肽的水解時間為3h、水解PH6.5、水解溫度40℃，酶與底物濃度比為1:200(v/v)；PFP水解脫脂乳粉物可以促進小鼠免疫器官的發(fā)育、刺激吞噬細胞