原料奶中熒光假單胞菌耐熱性脂肪酶周質表達及酶學特性研究.pdf

1、首先，建立了一個快速、靈敏度高的乳制品脂肪酶活檢測方法。在實驗室的前期工作中，從原料奶中分離出了一株產耐熱性脂肪酶的嗜冷菌，后經鑒定為熒光假單胞菌，并編號為B J-10（Pseudomonas fluorescensBJ-10）。在獲得此菌的基礎上，本文以其耐熱性脂肪酶(lipBJ10)為研究目標，以大腸桿菌為表達宿主菌對其進行過表達。采用信號肽融合表達技術實現(xiàn)lipBJ10可溶性、功能性的表達，探究了不同分泌類型的信號肽對于lipBJ

2、10周質分泌的影響，篩選出lipBJ10周質表達的最佳信號肽。優(yōu)化了最適周質表達條件，建立了高效、可行的分離純化策略，并研究了lipBJ10的酶學特性。
　　本研究的主要結論如下:
　　(1)建立了乳制品中脂肪酶高通量快速檢測方法:即利用含檸檬酸鈉的緩沖液澄清牛乳，除去乳脂肪的同時使難溶的酪蛋白膠束分散溶解，為分光光度法的應用制備出澄清的檢樣，以便于能夠使用分光光度法直接檢測脂肪酶活。在脂肪酶檢測過程中，步驟少、簡單、易于操

3、作、所需樣品和試劑少。該方法線的性相關性好、檢測靈敏度高，能夠應用于檢測市售的不同液態(tài)奶制品脂肪酶活，如巴氏奶和UHT奶。
　　(2)克隆出了lipBJ10的全長核酸序列，并經過同源比對確定其為脂肪酶超家族的第一大族I族脂肪酶，具體為I.3亞族。核酸和蛋白序列已經提交NCBI數(shù)據庫，GenBank登錄號為:KY939609。
　　(3)通過對比，溫度對過表達可溶性的lipBJ10的影響大于IPTG誘導濃度;在最適發(fā)酵溫度20

4、℃下，低IPTG誘導濃度有利于生成功能性lipBJ10。
　　(4)融合表達能夠有效的增強目標蛋白質的可溶性，提高lipBJ10的酶活性。當lipBJ10與DsbA融合表達時，周質酶活性達到最高的26541U/ml。經過綜合分析，DsbA是最適融合表達lipBJ10的信號肽。
　　(5)使用響應面法優(yōu)化了lipBJ10的表達條件，構建了一個可靠、準確的模型，建立了三因素的回歸擬合方程:Y(脂肪酶活/(U/ml))=27028

5、+2419A-18.82B-583C-55.98AB-3142AC+219BC-53.58A2-608B2-3184C2，其中，A代表溫度，B代表IPTG誘導濃度，C代表誘導時間?；貧w方程推測出的最佳過表達條件如下:誘導溫度2278℃、IPTG誘導濃度016mM、誘導時間381小時。該模型預測出的理論最大周質脂肪酶活性為282.019U/ml。經過驗證，優(yōu)化出的表達條件可靠。
　　(6)采用兩步法，先親和層析后凝膠過濾層析，成功的

6、分離純化出純度很高的lipBJ10樣品，為重組蛋白質的分離純化提供了一個值得借鑒參考的方法和策略。
　　(7)酶學性質研究表明lipBJ10是一種堿性脂肪酶，其最適pH值為8.6左右，最適溫度為45℃。Ca2+能顯著的提高lipBJ10的酶活性。EDTA能夠降低lipBJ10的酶活性，可能與脂肪酶結構中Ca2+的被螯合有關。重金屬離子能夠顯著的使lipBJ10喪失大部分酶活性。非離子型表面活性劑Triton X-100和陰離子表面