桑樹MaPGIP1基因克隆與表達分析.pdf

1、桑樹為多年生木本植物，屬于薔薇目(Rosales)?？?Moraceae)桑屬(Morus L.)桑種(Morusalba L.)。桑樹長期以來作為家蠶的飼料樹種，是“桑蠶-絲”產(chǎn)業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但桑樹還具有多種用途，如較強的生態(tài)學功能以及食用和藥用等價值，發(fā)展果桑產(chǎn)業(yè)在蠶桑資源綜合利用方面優(yōu)勢明顯，對優(yōu)化蠶桑產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，促進蠶農(nóng)增收具有重要意義。但果桑產(chǎn)業(yè)面臨著菌核病的嚴重威脅，該病是危害桑椹的主要真菌病害，其分布廣泛，病勢猛，對果桑

2、產(chǎn)業(yè)危害極大。
　　植物細胞壁是抵御病原菌侵染的第一道物理屏障。許多致病真菌能分泌多種水解植物細胞壁的酶類，多聚半乳糖醛酸酶(PG)是真菌分泌的第一個水解酶，被認為是一種重要的致病因子。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是普遍存在植物細胞壁的一種糖蛋白，能特異性的識別并抑制真菌PG酶，從而阻止了病原菌對植物的入侵。另外，PGIP對PG的抑制導致植物體內(nèi)積累有生物活性的寡糖，從而誘發(fā)植物抗病響應。PGIP是植物重要的防御蛋白，屬于

3、LRR蛋白超家族的一員。本研究從分析川?；蚪M信息入手，以重慶市審定的果桑品種‘嘉陵40號’(Morus atropurpureaRoxb.)為材料，從分子生物學角度，研究桑樹PGIP基因特征、表達及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。旨為桑樹功能基因研究與應用奠定基礎(chǔ)，同時為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗真菌病害的植物育種研究提供參考。本研究的結(jié)果如下:
　　1、桑樹MaPGIP1基因克隆與生物信息分析
　　根據(jù)川?；蚪M數(shù)據(jù)庫預測的PGIP基因設(shè)計

4、引物，用嘉陵40號桑作為供試材料，以cDNA為模板，克隆桑樹PGIP基因的全長。實驗結(jié)果是:其CDS序列全長為1017bp，編碼338個氨基酸。將該基因序列提交至NCBI，基因登錄號為GenBank: KJ704112，并命名為MaPGIP1。在線軟件預測MaPGIP1蛋白分子量37.9 kDa，理論等電點為6.65，分子式C1717H2650N442O495S14，酸性氨基酸(Asp+Glu)占9.8％，堿性氨基酸(Lys+Arg)占

5、9.5％，亮氨酸比例最高(13.3％);不穩(wěn)定系數(shù)為38.71，說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。MaPGIP1的信號肽為N端26個氨基酸殘基。MaPGIP1成熟肽氨基酸序列中具有4個潛在的N-糖基化位點，N端和C端各有4個參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。該基因編碼的蛋白質(zhì)主體結(jié)構(gòu)由9個串聯(lián)的LRRs基序組成;MaPGIP1氨基酸序列從第76個氨基酸開始的LRRs基序均具有“LxxLxLxxNxLS/TGxIPxxLxxL”（x代表任意氨基酸殘基）這

6、樣的共有序列。
　　運用Muscle軟件，對獲得的MaPGIP1基因進行氨基酸序列的多重比對分析，與已經(jīng)報道的擬南芥、菜豆和中國李PGIP蛋白的氨基酸序列同源性高達50％-65％，與川桑PGIP氨基酸序列同源性為84％，其序列的差異主要體現(xiàn)在非保守位點上。將獲得的桑樹MaPGIP1與已報道的其他物種的PGIP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類分析發(fā)現(xiàn)，PGIP蛋白的氨基酸序列分成2支，分別為單子葉植物和雙子葉植物。MaPGIP1與薔薇科

7、的中國李和桃等親緣關(guān)系比較近。
　　2、桑樹MaPGIP1基因組織表達分析及對非生物誘導響應
　　本實驗采用實時定量PCR技術(shù)研究了MaPGIP1基因在不同組織和桑椹不同發(fā)育時期的表達水平以及對非生物的誘導響應。發(fā)現(xiàn)該基因在根中的表達量最高，在幼葉中表達量次之，在皮中的表達量最低;另外，該基因在果實發(fā)育前中期的表達水平明顯高于后期;又分析檢測了經(jīng)水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、損傷以及低溫(4℃)處理24h的桑葉片中MaP

8、GIP1基因表達水平。結(jié)果表明，SA處理后，MaPGIP1的表達水平顯著升高，在處理3h后表達量最高，是未處理的25倍;ABA處理后，MaPGIP1基因表達水平降低到原來的五分之一到六分之一。機械損傷處理后，MaPGIP1表達水平升高，在6h表達量最高，是對照的4.5倍;低溫處理后，MaPGIP1基因表達表達水平先下降有上升再下降的趨勢，6h基因表達表達水平上調(diào)，是對照的1.4倍;24h表達水平是處理前的十分之一。
　　3、桑樹M

9、aPGIP1基因原核表達與功能分析
　　將MaPGIP1基因亞克隆到原核表達載體pET28a(+)中，成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-PGIP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，加入IPTG（終濃度0.5 mmol/L）進行誘導表達。目的蛋白以包涵體的形式存在。采用超聲波破碎方法裂解細胞，然后用8mol/L尿素溶解表達產(chǎn)物，通過Ni-NTA柱純化收集融合蛋白，純化后的目的蛋白經(jīng)Western Blot檢測，利用含有氧化還原

10、系統(tǒng)的復性緩沖液分步透析復性，最終獲得了具有活性的蛋白。
　　通過對離體的油菜葉片接種果桑肥大性菌核病菌（Ciboria shiraiana）證明MaPGIP1蛋白對該菌的抑制。實驗表明MaPGIP1蛋白對該菌在侵染油菜前期有一定的抑制效果，能緩解油菜葉片的感病癥狀。通過DNS法測定MaPGIP1蛋白對CsPG的抑制效果，結(jié)果表明，隨著MaPGIP1蛋白量的增加，CsPG將聚半乳糖醛酸裂解成D-半乳糖醛酸的量逐漸減少，這說明該菌對