MicroRNA-34a靶向抑制Notch1對(duì)浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、微小RNA(microRNAs或稱(chēng)miRNAs)是一段長(zhǎng)度約21-25核苷酸的小型非編碼RNA家族，其序列高度保守，miRNAs通過(guò)與靶基因的mRNA特異性識(shí)別，一方面可以在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)促進(jìn)靶基因mRNA降解，另一方面和/或抑制靶基因的翻譯過(guò)程。研究證實(shí)miRNAs參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等諸多生物學(xué)進(jìn)程。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a是一類(lèi)重要的抑癌因子。2008年，膀胱癌在全球約有386，300例新發(fā)病例和150，200例死亡病例，

2、是第五大常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是泌尿生殖腔道第二常見(jiàn)的腫瘤和泌尿生殖腔道惡性腫瘤中第二大致死原因。前期研究發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌中，Notch1起癌基因作用，能抑制尿路上皮癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)G1期阻滯。那么浸潤(rùn)性尿路上皮癌中，Notch通路調(diào)節(jié)因子是否包括miRNA，能作用于多種腫瘤的miR-34a是否能作用于Notch1？為尋找浸潤(rùn)性尿路上皮癌中調(diào)節(jié)Notch1的miRNA及其在浸潤(rùn)性尿路上皮癌中所發(fā)揮的生物學(xué)功能，我們主要研究?jī)?nèi)容如下

3、：
　　 1.miR-34a和Notch1在浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)譜
　　 我們實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默Notch1表達(dá)可抑制尿路上皮癌細(xì)胞株的增殖并引起G1期阻滯，Notch1基因的異?；罨怪诮?rùn)性尿路上皮癌中起癌基因作用。而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，miR-34a能靶向作用于Notch1，起抑癌因子的作用。為研究浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌中miR-34a和Notch1的關(guān)系，我們首先通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和蛋白印跡技術(shù)

4、在浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌和癌旁中檢測(cè)了miR-34a和Notch1的表達(dá)譜。結(jié)果表明，浸潤(rùn)性尿路上皮癌中miR-34a低表達(dá)，可能起到抑癌因子的作用；而Notch1 mRNA水平和蛋白水平都是高表達(dá)，浸潤(rùn)性尿路上皮癌中miR-34a與Notch1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這與其他類(lèi)型腫瘤中miR-34a與Notch1的相關(guān)研究類(lèi)似。通過(guò)浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織中miR-34a與Notch1表達(dá)譜的檢測(cè)，我們推測(cè)在浸潤(rùn)性尿路上皮癌中，miR-34

5、a可能是一種重要作用的抑癌因子，并能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)癌基因Notch1發(fā)揮作用。2.miRNA-34a與Notch1作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證
　　 通過(guò)表達(dá)譜檢測(cè)，我們推斷浸潤(rùn)性尿路上皮癌中，miR-34a可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)癌基因Notch1發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步闡明miRNA-34a與Notch1作用靶點(diǎn)，我們利用生物信息學(xué)軟件和熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)在預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)顯示，在人尿路上皮癌細(xì)胞株T24和5637中過(guò)表達(dá)miR

6、-34a后，相對(duì)熒光素酶活性下降，這結(jié)果說(shuō)明尿路上皮癌細(xì)胞中，miR-34a通過(guò)直接結(jié)合Notch13'UTR的方式靶向作用于Notch1。同時(shí)，我們還在過(guò)表達(dá)miR-34a之后檢測(cè)了細(xì)胞株中Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，這進(jìn)一步說(shuō)明miR-34a能通過(guò)與Notch1的3'UTR作用，靶向抑制Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。3.miRNA-34a靶向Not

7、ch1對(duì)浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響
　　 為了探討浸潤(rùn)性尿路上皮癌中miR-34a的生物學(xué)效應(yīng)，我們以人尿路上皮癌細(xì)胞株T24和5637為模型，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-34a和si-Notch1，觀察細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移和侵襲的變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-34a和沉默Notch1能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)G1期阻滯并降低細(xì)胞遷移力和侵襲力。揭示miR-34a能通過(guò)靶向抑制癌基因Notch1，在尿路上皮癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌因子的作

8、用。
　　 綜上所述，本次研究通過(guò)在浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織水平和細(xì)胞水平對(duì)miR-34a的深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在浸潤(rùn)性尿路上皮癌中發(fā)揮著重要的抑癌因子的作用，其機(jī)制和生物學(xué)效應(yīng)如下：1)浸潤(rùn)性尿路上皮癌中miR-34a低表達(dá)，Notch1高表達(dá)，并且兩者呈負(fù)相關(guān)；2)miR-34a通過(guò)作用于Notch13'UTR，靶向調(diào)節(jié)Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)；3)miR-34a通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Notch1，抑制膀胱尿路上皮癌細(xì)胞增