SIVmac239和SHIV-,CHN19P4-新方法感染中國(guó)恒河猴及艾滋病疫苗免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、目前，艾滋病已成為影響人類健康的最嚴(yán)重的傳染性疾病之一。世界各國(guó)嚴(yán)峻的流行形勢(shì)迫切需要研制出安全有效的預(yù)防性艾滋病疫苗。疫苗的安全性、有效性以及免疫策略需要在合適的動(dòng)物模型中進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 SIVmac239恒河猴模型是經(jīng)典的艾滋病動(dòng)物模型，在國(guó)外已經(jīng)進(jìn)行了二十幾年的探索研究。我國(guó)科學(xué)家對(duì)SIVmac239中國(guó)恒河猴模型研究也有二十幾年的時(shí)間，但研究多側(cè)重于靜脈、粘膜的一次大量攻毒基礎(chǔ)之上。本研究參照HIV性傳播自然感染劑量范

2、圍，選用SIVmac239連續(xù)升高的3種劑量直腸粘膜途徑感染兩只恒河猴，采取多種方法進(jìn)行病毒血癥和免疫反應(yīng)特點(diǎn)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩只中國(guó)恒河猴經(jīng)2×101TCID50和2×102 TCID50病毒滴度2次攻擊45d后，經(jīng)檢測(cè)均未建立系統(tǒng)性感染，病毒特異性免疫反應(yīng)均為陰性；第3次2×103TCID50病毒滴度攻擊后，M296猴表現(xiàn)出典型的系統(tǒng)性感染特點(diǎn)，并誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。通過模擬HIV性傳播感染特點(diǎn)進(jìn)行恒河猴直腸粘膜感染研究，探索引起

3、系統(tǒng)性感染的病毒閾值水平與機(jī)體病毒、免疫學(xué)之間相關(guān)性，為我國(guó)艾滋病粘膜疫苗等生物制劑有效性評(píng)價(jià)提供新的模型構(gòu)建思路。
　　 包含中國(guó)HIV-1 CRF07_BC主要流行株基因CCR5嗜性的致病性SHIV/中國(guó)恒河猴艾滋病模型在基于中國(guó)HIV-1主要流行株設(shè)計(jì)的艾滋病疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)中可以發(fā)揮非常重要的作用。SHIVCHN19感染性分子克隆是由SIVmac239的5’-PVP-1質(zhì)粒與3’-pCHN19質(zhì)粒構(gòu)建而成。之后經(jīng)過連

4、續(xù)四代傳代形成毒力增強(qiáng)的SHIVCHN19P4。本研究將SHIVCHN19P4在中國(guó)恒河猴體內(nèi)快速傳代。經(jīng)過兩代連續(xù)猴體傳代后，通過病毒載量和外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)SHIVCHN19P4病毒在猴體傳代過程中表現(xiàn)出病毒毒力進(jìn)一步增強(qiáng)的特點(diǎn)。然后我們將毒力表現(xiàn)最強(qiáng)的恒河猴G0603V病毒分離出來(lái)，進(jìn)行序列分析，尋找其毒力增強(qiáng)的原因，并制備出SHIVCHN19P4中國(guó)恒河猴傳代適應(yīng)株，命名為SHIVCHN19P5。本研究課題為進(jìn)

5、一步建立C亞型SHIV強(qiáng)毒株/中國(guó)恒河猴模型奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為研究C亞型HIV-1流行株致病特點(diǎn)以及預(yù)防性粘膜疫苗和殺微生物劑的有效性評(píng)價(jià)提供了數(shù)據(jù)支持。
　　 本課題評(píng)價(jià)了兩株由香港大學(xué)研制的包含SIVmac239病毒的gag，pol和env基因的DNA疫苗和非復(fù)制性痘苗天壇減毒株艾滋病疫苗（MVTT-SIVgpe）。本課題采用MVTT-SIVgpe/pSIVgpe聯(lián)合免疫的策略免疫4只中國(guó)恒河猴，并選用4只中國(guó)恒河猴做

6、為空載體對(duì)照組。免疫后，檢測(cè)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。HIV特異性結(jié)合抗體滴度和IFN-γ分泌性T細(xì)胞免疫反應(yīng)分別采用ELISA和ELISPOT方法分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該聯(lián)合免疫疫苗IFN-γ分泌性T細(xì)胞免疫反應(yīng)較強(qiáng)，但是HIV特異性結(jié)合抗體滴度較弱。該疫苗用于研究艾滋病疫苗在恒河猴機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)理和作用效果，對(duì)揭示人用疫苗的作用機(jī)理以及艾滋病的發(fā)病機(jī)制有重要的借鑒意義。
　　 為了研究CD8+T細(xì)胞體內(nèi)對(duì)病毒作用，本研究將進(jìn)入艾滋病感

7、染潛伏期的四只恒河猴使用人鼠嵌合單克隆抗體cM-T807敲除體內(nèi)CD8+T細(xì)胞，之后通過病毒載量、CD8+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)、IFN-γ，分泌性T細(xì)胞免疫反應(yīng)等研究敲除后CD8+T細(xì)胞敲除與病毒載量走勢(shì)的關(guān)系以及敲除前后IFN-γ分泌性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的差異。結(jié)果表明在CD8+T細(xì)胞敲除后21d四只恒河猴病毒載量均發(fā)生了反彈，但峰值較低，持續(xù)時(shí)間也較短，敲除前后IFN-γ分泌性T細(xì)胞免疫反應(yīng)差異較小。本研究使用CD8+T細(xì)胞體內(nèi)敲除抗體能夠選擇

8、性去除中國(guó)恒河猴艾滋病模型的CD8+T細(xì)胞，有助于我們研究病毒感染的急性期和慢病毒感染過程中病毒的復(fù)制和病毒的致病機(jī)制。
　　 綜上所述，本課題通過模擬HIV性傳播感染特點(diǎn)進(jìn)行恒河猴直腸粘膜感染研究，確認(rèn)了HIV性傳播過程中的病毒劑量效應(yīng)關(guān)系；通過SHIVCHN19P4在中國(guó)恒河猴體內(nèi)適應(yīng)性傳代研究發(fā)現(xiàn)病毒毒力增強(qiáng)，并制備出SHIVCHN19P4中國(guó)恒河猴傳代適應(yīng)株-SHIVCHN19P5；通過MVTT-SIVgpe/pSIVg