重組人肝再生增強(qiáng)因子反式激活作用的研究.pdf

1、目的:(1)應(yīng)用抑制性削減雜交技術(shù)篩選重組人肝再生增強(qiáng)因子(rhALR)反式激活的基因，探討rhALR刺激肝細(xì)胞再生的作用機(jī)制； (2)研究重組人肝再生增強(qiáng)因子(rhALR)對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cdk1)基因的反式激活作用。 方法:(1)應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)，表達(dá)、純化重組人肝再生增強(qiáng)因子蛋白.體外刺激HepG2細(xì)胞，以溶劑pH7.8的磷酸鹽緩沖液為平行對(duì)照，制備作用后的細(xì)胞裂解液，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)Rsa

2、 Ⅰ酶切后，將實(shí)驗(yàn)組cDNA分成兩組，分別與兩種不同的接頭銜接，再與對(duì)照組cDNA進(jìn)行兩次消減雜交及兩次抑制性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，將產(chǎn)物與T/A載體連接，構(gòu)建cDNA消減文庫(kù)，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，隨機(jī)挑選克隆PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序及同源性分析。(2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增人cdk1基因啟動(dòng)子，命名為cdk1P。以T-A克隆法，將cdk1P基因片段連入載體pGEM-T。將獲得的質(zhì)粒pGEMT-CDK1P，與報(bào)告質(zhì)粒pCAT3

3、-basic分別用KpnI和Xhol Ⅰ雙酶切后構(gòu)建cdk1啟動(dòng)子報(bào)告基因表達(dá)載體pCAT3-cdk1P，以重組表達(dá)質(zhì)粒pCAT3-cdk1P瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，然后用rhALR刺激，以轉(zhuǎn)染pCAT3 basic的HepG2細(xì)胞為陰性對(duì)照，48h后收獲細(xì)胞。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞中氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的表達(dá)活性，以了解重組人肝再生增強(qiáng)因子與cdk1基因表達(dá)的關(guān)系。 結(jié)論:(1)篩選到的cDNA全長(zhǎng)序列，