小檗堿對胰島β細胞功能的影響及其衍生物抗糖尿病活性的研究.pdf

1、糖尿病是以血糖增高為主要表現(xiàn)的累及全身的代謝性疾病，但血糖的增高僅發(fā)生在胰島β細胞功能受損、衰竭時。近年來，β細胞功能的研究已成為糖尿病研究的重點方向，而其內(nèi)容主要包括胰島素分泌及胰島素合成兩方面。隨著糖尿病研究理論的更新以及新的作用機制的不斷發(fā)現(xiàn)，抗糖尿病藥物也從最早的以“竭澤而漁”式的刺激胰島素分泌降低血糖為目的，發(fā)展為以通過降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗、緩解并發(fā)癥并抑制β細胞凋亡達到多方位綜合治療糖尿病為目標。而保護β細胞功

2、能則成為抗糖尿病藥物研究的熱點。小檗堿是中藥黃連中的主要生物堿，其抗糖尿病作用多年前已被報道。近年來又發(fā)現(xiàn)其具有降低血甘油三酯及膽固醇的作用，并可能促進GLP-1的分泌，提示其進一步開發(fā)應用的價值很大。關于小檗堿對外周胰島素敏感組織的作用機制研究較多，但其對胰島β細胞功能的研究鮮見，本論文以考察小檗堿對胰島β細胞功能的影響為目的，重點研究其對胰島素基因表達的影響，并研究小檗堿結構修飾的化合物的抗糖尿病活性。
　　 論文第一部分考

3、察了鹽酸小檗堿(50 mg/kg)對代謝綜合征動物模型MSG小鼠及2型糖尿病動物模型C57/BL小鼠的抗糖尿病活性并初步評價了其在整體水平對胰島β細胞的影響。實驗結果顯示，在兩種小鼠模型，鹽酸小檗堿能夠顯著改善動物的胰島素抵抗狀態(tài)及葡萄糖耐量異常狀態(tài);降低空腹血清胰島素水平;有降低小鼠胰腺脂質(zhì)積聚的趨勢。這些結果提示小檗堿通過改善糖脂代謝，減輕了糖脂對β細胞的毒性作用，對β細胞發(fā)揮有益作用。胰島病理切片結果顯示鹽酸小檗堿能夠延緩C57/

4、BL小鼠胰腺組織病變進展，維持β細胞形態(tài);兩種動物模型的胰島素免疫組織化學染色均顯示動物胰島內(nèi)胰島素含量降低，提示小檗堿對胰島β細胞胰島素表達可能存在直接的調(diào)控作用。
　　 在第一部分研究結果的基礎上，論文第二部分進行體外實驗，主要目的是考察鹽酸小檗堿對胰島β細胞的胰島素水平是否具有直接調(diào)節(jié)作用并探討其機制及意義。實驗中通過Real time PCR的方法證明了鹽酸小檗堿對胰島β細胞系NIT-1細胞及正常ICR小鼠原代胰島內(nèi)胰島

5、素基因Ins-1及Ins-2表達產(chǎn)生抑制作用，并且這種表達抑制作用在蛋白水平亦能夠體現(xiàn)。為了進一步研究鹽酸小檗堿對胰島素基因表達的調(diào)控機制，本部分論文中建立了考察胰島素基因啟動子活性的研究方法。實驗中通過應用不同濃度的葡萄糖、軟脂酸及陽性參照藥物exendin-4，證明所構建的兩種報告基因質(zhì)粒對于調(diào)節(jié)胰島素基因表達的生理性物質(zhì)及外源性藥物反應敏感準確，證明該方法可用于進一步考察藥物對啟動子的調(diào)控。隨后的實驗中應用所構建的質(zhì)?？疾禧}酸小檗

6、堿的作用，結果顯示，鹽酸小檗堿對胰島素基因啟動子活性具有抑制作用，這種抑制作用存在明顯量效及時程關系，并與文獻中與其作用機制相似的藥物鹽酸二甲雙胍存在較明顯的差別。本部分最后進行了信號通路的研究及功能意義的初步探討，結果顯示AMPK抑制劑Compound C能夠阻斷小檗堿對胰島素基因表達的下調(diào)作用，提示小檗堿對胰島素基因表達的調(diào)控依賴于此通路。Real time PCR還顯示小檗堿能夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路關鍵蛋白CHOP的mRNA表達，提

7、示其可能通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力改善β細胞功能。轉錄因子mRNA水平測定表明，Pdx-1可能參與小檗堿對胰島素基因表達的調(diào)節(jié)。
　　 國內(nèi)已有報道以小檗堿化學結構為先導化合物，通過研究其衍生物發(fā)現(xiàn)調(diào)脂作用更好的化合物，從而提示此方面研究的重要意義。論文第三部分首先應用葡萄糖消耗實驗，測定系列小檗堿衍生化合物對肝細胞系及前脂肪細胞葡萄糖消耗的影響并與小檗堿作對比，從48個化合物中篩選出6個進行整體動物實驗，并發(fā)現(xiàn)化合物WS0704002