磁珠濃縮低濃度HBsAg方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　乙型肝炎病毒（Hepqtitis B virus，HBV）感染是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）是乙型肝炎診斷及治療評(píng)估中非常重要的血清學(xué)標(biāo)志物。在HBV感染的“窗口期”、急性期后或恢復(fù)期、自限性感染末期的攜帶者等情況下，人體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)低濃度的HBsAg。HBsAg濃度低的患者可能存在著肝臟的持續(xù)性損傷和病毒復(fù)制，如果漏檢，可能影響患者的及

2、時(shí)治療，或者導(dǎo)致HBV通過(guò)手術(shù)、輸血等途徑傳播。對(duì)低濃度血清HBsAg進(jìn)行有效檢測(cè)，具有重要的臨床和流行病學(xué)意義。
　　目前檢測(cè)低濃度HBsAg靈敏度較高的方法是化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA），但由于需要大型儀器，基層醫(yī)院很難普及，檢測(cè)費(fèi)用也比較高，大多數(shù)患者難以承受，有一定的局限性。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，E

3、LISA）檢測(cè)HBsAg具有簡(jiǎn)單、方便、快速的優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度不高，在HBsAg濃度比較低的情況下，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)弱陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。如何比較有效和經(jīng)濟(jì)的提高ELISA檢測(cè)HBsAg的靈敏度是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。
　　本課題建立基于磁珠為介質(zhì)的濃縮方法（磁珠濃縮法），分析磁珠濃縮方法的特點(diǎn)，用于提高ELISA檢測(cè)低濃度HBsAg的靈敏度與陽(yáng)性檢出率。結(jié)果將闡明磁珠吸附蛋白質(zhì)的機(jī)理，使磁珠提取蛋白在更多的蛋白質(zhì)上進(jìn)行推廣發(fā)揮作用；尋找合理的吸

4、附純HBsAg與血清HBsAg的實(shí)驗(yàn)條件，為磁珠在吸附與分離臨床上其它蛋白質(zhì)的運(yùn)用提供借鑒；闡明磁珠濃縮 HBsAg的作用，為臨床提高ELISA檢測(cè)低濃度HBsAg靈敏度提供有效的濃縮方法，使磁珠濃縮方法在臨床上推廣。
　　目的：
　　1.通過(guò)研究羧基磁珠吸附純HBsAg和血清中HBsAg的性能，確定磁珠濃縮血清HBsAg的方法。與其它蛋白濃縮方法（高速離心、聚乙二醇透析、聚丙烯凝膠顆粒吸附、真空抽干）比較，分析磁珠濃縮法的

5、特點(diǎn)。
　　2.確定磁珠濃縮法所能達(dá)到的最低檢出限，探討磁珠濃縮法在提高檢測(cè)低濃度HBsAg靈敏度與陽(yáng)性檢出率中的意義。磁珠濃縮HBeAg與HBVDNA陽(yáng)性的血清標(biāo)本，探討磁珠濃縮方法在乙型肝炎其它檢測(cè)項(xiàng)目中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　1. BCA蛋白檢測(cè)法檢測(cè)磁珠吸附血源性HBsAg純品前后的蛋白量，改變磁珠用量、吸附時(shí)間、吸附溫度等條件，探討磁珠吸附HBsAg的性能；ELISA試劑盒檢測(cè)磁珠吸附血清HBsAg前后

6、的吸光度值，改變磁珠用量、血清pH值、吸附溫度、吸附時(shí)間、PBS的pH值、洗脫液的種類(lèi)與濃度等條件，建立最佳的磁珠濃縮血清HBsAg的實(shí)驗(yàn)條件。
　　2.分別使用磁珠濃縮法、高速離心、聚乙二醇透析、聚丙烯凝膠顆粒吸附、真空抽干濃縮處理血清標(biāo)本，比較濃縮前后ELISA檢測(cè)的HBsAg的結(jié)果，并比較五種濃縮方法的差異，分析磁珠濃縮法的優(yōu)越性與可行性。
　　3.標(biāo)定HBsAg陽(yáng)性臨床血清，判斷磁珠濃縮后ELISA檢測(cè)HBsAg的最

7、低檢出限；磁珠濃縮HBsAg陰性、不同稀釋液稀釋HBsAg陽(yáng)性血清、低濃度HBsAg血清后，判斷磁珠是否會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性、是否受到其它微生物影響、是否能提高低濃度HBsAg的陽(yáng)性檢出率。
　　4. SDS-PAGE法電泳磁珠濃縮乙肝大三陽(yáng)血清后的洗脫液，判斷磁珠吸附蛋白的特異性；ELISA法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)磁珠濃縮前后HBeAg和HBVDNA的結(jié)果，判斷磁珠是否對(duì)HBeAg和HBVDNA的檢測(cè)也具有濃縮作用。
　　

8、結(jié)果：
　　1.磁珠吸附HBsAg的能力受HBsAg的濃度、溫度、磁珠用量、溫育時(shí)間的影響。吸附上的純HBsAg，使用10 mMNaOH洗脫后，洗脫率是71.02％，生物活性保留率為88.15%。磁珠吸附血清中HBsAg的能力受磁珠用量、溫度、吸附時(shí)間、血清與PBS的pH值、洗脫液的種類(lèi)與濃度等因素影響。
　　2.磁珠濃縮法、高速離心、聚乙二醇透析、聚丙烯酰胺凝膠顆粒吸附、真空抽干濃縮血清標(biāo)本后的S/CO值均高于濃縮前（P＜

9、0.01）。任何兩種濃縮方法都有明顯的差異（P<0.01），濃縮水平由高至低依次為：冷凍干燥、磁珠吸附法、高速離心、聚乙二醇透析法、聚丙烯酰胺凝膠吸附法。
　　3.磁珠濃縮后ELISA檢測(cè)HBsAg的最低檢出限是0.1 IU/ml，靈敏度高于濃縮前（最低檢出限為0.6 IU/ml），濃縮后S/CO值與HBsAg濃度的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（r）為0.998，略高于濃縮前（r=0.990）。并沒(méi)有增加HBsAg陰性血清的S/CO值（P>0.0

10、5）；陰性血清、HCV陽(yáng)性血清、梅毒陽(yáng)性血清稀釋HBsAg陽(yáng)性標(biāo)本，濃縮前后的S/CO值無(wú)差異（P>0.05）； HBsAg弱陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)過(guò)磁珠濃縮后，陽(yáng)性檢出率為82.1%，與濃縮前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.765，P<0.01）。
　　4.洗脫液進(jìn)行電泳后，條帶比較復(fù)雜，除了有與 HBsAg純品一致的條帶，還有其它的雜帶；磁珠濃縮后HBeAg的S/CO值和HBVDNA的濃度均高于濃縮前（P<0.01）。
　　結(jié)論

11、：
　　1.成功建立磁珠濃縮方法，具有簡(jiǎn)單、快速、成本低廉等特點(diǎn)，但容易受磁珠用量、溫度、吸附時(shí)間、pH值等多種因素影響。
　　2.磁珠濃縮方法可以提高ELISA檢測(cè)HBsAg的靈敏度，可以用于臨床上提高低濃度HBsAg的檢出率，對(duì)監(jiān)測(cè)血清中低濃度HBsAg具有重要意義。
　　3.磁珠濃縮方法與其它濃縮方法比較，具有簡(jiǎn)單、方便、快速的優(yōu)點(diǎn)，很適合在臨床與血站推廣使用。
　　4.磁珠濃縮方法濃縮蛋白是利用電子交換原