人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞中乙肝病毒X蛋白對(duì)Cox-2表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的：乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染與肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的發(fā)生密切相關(guān)，HBV感染者發(fā)生HCC的危險(xiǎn)性是無(wú)HBV感染者的200多倍。但是，至今HBV導(dǎo)致肝硬化和肝癌的機(jī)制仍不十分清晰。乙肝病毒x(hepatitis B virus x protein，HBx)蛋白具有多種生物學(xué)功能，可與宿主細(xì)胞的多種蛋白相互作用，調(diào)控宿主細(xì)胞基因表達(dá)，進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化等，其對(duì)肝細(xì)胞周期與凋亡的影響是HBV致HCC發(fā)生的重要機(jī)制之一。HBV感染可激活多種信號(hào)通路并影響炎癥相關(guān)基因，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因，環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)基因和干擾素(IFN)等的表達(dá)。Cox是前列腺素(PGs)合成過(guò)程中的限速酶，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻GH2。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸代謝產(chǎn)物與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，HBV陽(yáng)性的慢性肝炎、肝硬化和HCC

3、患者肝組織中Cox-2的表達(dá)明顯高于正常組織或癌旁正常組織，并且Cox-2與HBx蛋白促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移作用有關(guān)，提示Cox-2的過(guò)度表達(dá)在HBV病毒致病過(guò)程中起一定作用。本研究擬探討乙肝病毒X蛋白在人肝母細(xì)胞瘤(HepG2)細(xì)胞中對(duì)Cox-2表達(dá)的影響，并觀察對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的作用，為進(jìn)一步闡明乙肝病毒X蛋白在HBV致病過(guò)程中的作用機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：首先設(shè)計(jì)擴(kuò)增HBV X蛋白的擴(kuò)增引物；從HBV患者血清中P

4、CR擴(kuò)增得到HBx基因；純化后與T載體(pGEM-T)連接，通用引物T7/SP6擴(kuò)增鑒定克隆重組子，并進(jìn)行測(cè)序分析，得到克隆重組子(pGEM-T-HBx)。BglII和EcoR I雙酶切pGEM-T-HBx，回收雙粘HBx基因片段，與表達(dá)載體pIRES2-AcGFP聯(lián)接；用BglII和EcoR I雙切鑒定亞克隆重組子pIRES2-AcGFP-HBx，并對(duì)pIRES2-AcGFP-HBx插入序列測(cè)序分析。脂質(zhì)體包裹pIRES2-AcGFP

5、-HBx轉(zhuǎn)染科HepG2細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。RT-PCR和Western-Blot檢測(cè)HBx和Cox-2 mRNA和蛋白表達(dá)情況；螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)HBx蛋白對(duì)Cox-2基因啟動(dòng)子的作用：MTT法、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.從HBV病人血清擴(kuò)增得到465bp的HBx目的基因；T7/SP6擴(kuò)增篩選得到克隆重組子(pGEM-T-HBx)；BglII和

6、EcoR I雙酶切鑒和測(cè)序證實(shí)亞克隆重組子pIRES2-AcGFP-HBx正確。
　　 2.HBx mRNA和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-HBx的HBx蛋白表達(dá)組HepG2細(xì)胞中可見(jiàn)高水平的HBx mRNA和蛋白表達(dá)，HBx基因轉(zhuǎn)染篩選成功。
　　 3.HBx蛋白表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP-HBx的HepG2細(xì)胞)細(xì)胞Cox-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.76±0.12，

7、載體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP的HepG2細(xì)胞)的相對(duì)表達(dá)量為0.28±0.04、空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞)的相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.03；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HBx蛋白表達(dá)組細(xì)胞Cox-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于載體對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有非常顯著性(P<0.01)。
　　 4.Cox-2蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：有HBx蛋白表達(dá)的HepG2細(xì)胞中Cox-2蛋白表達(dá)顯著升高。
　　 5.HBx蛋白表達(dá)

8、組細(xì)胞Cox-2啟動(dòng)子螢光素酶熒光度值為1675.2±84.9，載體對(duì)照組的熒光度值為657.7±34.7、空白對(duì)照組的熒光度值為739.3±45.3；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析HBx蛋白表達(dá)組細(xì)胞Cox-2啟動(dòng)子螢光素酶熒光度值顯著高于載體對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 6.HBx蛋白表達(dá)組細(xì)胞在3d、4d、5d生長(zhǎng)顯著加快，與載體對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞MTT測(cè)定結(jié)果比較差異均有顯著性(P<0.05)。
　　

9、 7.載體對(duì)照組與空載體對(duì)照組之間G0～G1期、G2～M期、S期比例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無(wú)顯著性(P>0.05)。而HBx蛋白表達(dá)組與2個(gè)對(duì)照組比較，G0～G1期比例顯著降低，S期和G2～M期比例顯著增加，差性有顯著性(P<0.05)。
　　 結(jié)論：在HepG2細(xì)胞中，HBx蛋白對(duì)Cox-2啟動(dòng)子活性有顯著提高作用，HBx蛋白可顯著升高細(xì)胞中Cox-2蛋白表達(dá)水平：HBx蛋白可促進(jìn)HepG2細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。