小鼠腎臟缺血再灌注損傷中5hmC的動(dòng)態(tài)變化及其與基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系.pdf

1、第一部分5mC和5hmC在小鼠不同器官基因組DNA中的含量與分布規(guī)律
　　目的:DNA甲基化(5mC)和羥甲基化(5hmC)是表觀遺傳修飾的重要組成部分。已有研究報(bào)道了不同組織或器官內(nèi)基因組5mC和5hmC含量存在差異，但對(duì)于不同組織內(nèi)5mC或5hmC在全基因組的分布規(guī)律我們卻知之甚少。因此，我們對(duì)小鼠不同器官基因組DNA中5mC和5hmC含量進(jìn)行了驗(yàn)證，并對(duì)不同器官DNA甲基組和羥甲基組進(jìn)行初步分析，觀察并總結(jié)5mC和5hmC的

2、全基因組分布規(guī)律。
　　方法:摘取正常雄性C57小鼠不同器官，抽提基因組DNA。采用DNA點(diǎn)雜交方法檢測(cè)5mC和5hmC在小鼠不同器官基因組中的含量變化，并利用DNA-特異性抗體免疫沉淀方法富集小鼠心臟，肝臟，腎臟，肺，腦皮質(zhì)和小腦基因組中含5mC或5hmC的DNA片段，通過全基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析比較不同器官DNA甲基組和羥甲基組信息。
　　結(jié)果:點(diǎn)雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠不同器官5hmC含量存在顯著差異，與5mC含量無明

3、顯相關(guān)性。對(duì)六種小鼠器官基因組DNA5mC和5hmC的測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步印證了上述結(jié)論。分析5mC/5hmC在不同基因區(qū)域比例發(fā)現(xiàn)，5hmC多見于基因本體，5mC則大量分布于基因間區(qū)域。觀察小鼠不同器官5mC或5hmC在基因本體區(qū)域的分布，5mC或5hmC的富集趨勢(shì)無組織間差異。對(duì)小鼠腎臟及腦皮質(zhì)基因啟動(dòng)子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)5mC和5hmC的分布分析進(jìn)一步證明了兩種DNA修飾分布特點(diǎn)的不同。
　　結(jié)論:小鼠不同器官基因組DNA中5mC含量差

4、異較小，但5hmC含量差異顯著。小鼠不同器官基因組DNA中中5mC或5hmC在基因組特征性區(qū)域（啟動(dòng)子、基因本體區(qū)）的富集趨勢(shì)類似，但富集程度存在差異。5hmC在全基因組范圍的分布特點(diǎn)與5mC存在差異。
　　第二部分缺血再灌注損傷引起小鼠腎臟基因組DNA中5hmC含量減少
　　目的:圍術(shù)期腎臟缺血再灌注(Ischemia Reperfusion，IR)損傷十分常見，可引起急性腎功能不全。已有研究發(fā)現(xiàn)腦IRI后DNA甲基化(5

5、mC)水平明顯增加，且與損傷預(yù)后密切相關(guān)，但尚無研究報(bào)道腎臟IR中DNA羥甲基化(5hmC)含量的變化和作用。因此，我們以小鼠IR腎臟為模型觀察IR對(duì)基因組DNA中5mC和5hmC含量的影響，探索5hmC與IR中基因轉(zhuǎn)錄重編程的聯(lián)系。
　　方法:以雄性C57小鼠為研究對(duì)象，采用左側(cè)腎動(dòng)脈阻斷40分鐘恢復(fù)血供建立小鼠腎臟IR模型，右側(cè)腎臟為對(duì)照。根據(jù)再灌注時(shí)間將小鼠分為再灌注4小時(shí)和24小時(shí)組(n=5)。于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死小鼠留取腎臟

6、組織行甲醛固定或液氮保存。組織切片HE染色及RT-qPCR檢測(cè)IR特異性標(biāo)志物確認(rèn)建模效果。DNA點(diǎn)雜交及免疫組化檢測(cè)5mC，5hmC含量。DNA-抗體免疫共沉淀聯(lián)合qPCR檢測(cè)特定基因位點(diǎn)5hmC變化，RT-QPCR檢測(cè)這些基因及雙加氧酶TET蛋白家族mRNA水平變化，分析5hmC含量變化的可能機(jī)制及其對(duì)基因表達(dá)調(diào)控可能產(chǎn)生的影響。
　　結(jié)果:明確建模效果后，我們發(fā)現(xiàn)再灌注4小時(shí)組小鼠腎臟5mC，5hmC含量無明顯變化，再灌注2

7、4小時(shí)組小鼠腎臟5mC含量不變但5hmC含量明顯降低。檢測(cè)特定基因位點(diǎn)5hmC含量后發(fā)現(xiàn)，IR腎臟中基因啟動(dòng)子區(qū)5hmC減少;同時(shí)這些基因mRNA水平增加。對(duì)TET蛋白家族成員mRNA水平的檢測(cè)顯示，IR引起Tet1和Tet2表達(dá)下調(diào)，Tet3未受影響。
　　結(jié)論:IR影響小鼠腎臟的Tet1和Tet2表達(dá)，并引起基因組DNA5hmC含量減少。這些表觀遺傳修飾的變化很可能參與了IR的基因轉(zhuǎn)錄重編程。
　　第三部分小鼠腎臟缺血再

8、灌注中5mC，5hmC的全基因組范圍分析
　　目的:近年來對(duì)IR損傷中表觀遺傳學(xué)變化及其作用的研究日趨增多，且均證實(shí)表觀遺傳調(diào)控與IR中的基因轉(zhuǎn)錄重編程存在緊密聯(lián)系。我們?cè)诘诙糠值难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟IR會(huì)引起腎臟基因組5mC總量雖無變化，但5hmC總量減少，且對(duì)但基因位點(diǎn)5hmC的檢測(cè)提示5hmC的變化與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們觀察了IR對(duì)小鼠腎臟基因組5mC，5hmC分布規(guī)律的變化，并結(jié)合小鼠腎臟IR基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)

9、進(jìn)行5mC，5hmC的基因組學(xué)分析，研究5mC，5hmC與基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)性。
　　方法:采用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)對(duì)照與缺血再灌注后24小時(shí)小鼠腎臟組織的基因表達(dá)水平。通過DNA-抗體免疫沉淀方法分別富集含5mC或5hmC的DNA片段，利用全基因組測(cè)序技術(shù)獲得對(duì)照組及IR組腎臟5mC和5hmC在全基因組范圍的分布信息。利用MAT等生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行5mC，5hmC變化與基因表達(dá)變化的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:IR引起小鼠腎

10、臟基因轉(zhuǎn)錄的劇烈變化，并且隨著再灌注時(shí)間的延長，IR引起的基因轉(zhuǎn)錄重編程影響范圍逐漸擴(kuò)大，基因表達(dá)譜變化與IR損傷的演變進(jìn)程相一致。雖然IR會(huì)造成5hmC總量變化，但不會(huì)對(duì)5mC，5hmC在全基因組的分布規(guī)律產(chǎn)生影響。基因表達(dá)靜態(tài)數(shù)據(jù)與測(cè)序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析提示，基因轉(zhuǎn)錄活躍基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近5mC含量很低，而基因本體區(qū)域5hmC含量較高。分析IR引起的基因動(dòng)態(tài)變化和特定基因區(qū)域5mC，5hmC含量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟中基因本體區(qū)5h