東海原甲藻磷脅迫響應(yīng)基因的分析及細(xì)胞死亡相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、本文構(gòu)建了對數(shù)生長期東海原甲藻的cDNA文庫。使用mRNAPurification Kit MagExtractor -mRNA-提取純化對數(shù)生長期東海原甲藻poly(A)<'+>RNA，使用Super SMART<'TM>PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒將poly(A)<'+> RNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將cDNA連接到pMD 18-T vector載體上，并電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E coli JM

2、109。結(jié)果顯示，感受態(tài)細(xì)胞電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率大于10<'9>，并且，絕大部分插入片斷大小在500-1500bp之間。使用此種方法，使我們能夠?qū)ξ⒘繓|海原甲藻細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)小于10<'5>個細(xì)胞)構(gòu)建cDNA文庫。 以正常磷酸鹽營養(yǎng)濃度培養(yǎng)條件下的東海原甲藻為對照組，使用cDNA-AFLP技術(shù)對磷脅迫下的東海原甲藻的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。通過AFLP分析，共分離了50條表達(dá)差異條帶，最后到43條有效序列。網(wǎng)上BLAST分析結(jié)果顯示，其中

3、8條序列搜尋到匹配序列，而剩余的35條序列則未搜尋到匹配序列。以β-actin為參照基因，進(jìn)一步對其中的三個基因片斷進(jìn)行了表達(dá)差異分析，結(jié)果表明，在受到磷酸鹽脅迫時，這三個片斷所代表基因的表達(dá)量全部有所增加，并且與對照相比，差異顯著。其中，基因片段TDF72(antioxidant，AhpC/Tsa family)的表達(dá)量在磷脅迫時是對照組的1.24倍(p=0.04)；TDF68(dual-specificity protein pho

4、sphatase)是對照組的1.60倍(p=0.002)TDF85(Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mlatase)是對照組的2.30倍(p=0.0001)。通常認(rèn)為，單細(xì)胞浮游藻是"不死"的，除非是被捕食、或者被病毒或細(xì)菌感染致死、或者是受到物理損傷、或者是永久的、不可逆轉(zhuǎn)的沉降到海洋深處。然而，以往研究資料顯示，當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境脅迫時，在單細(xì)胞真核浮游植物中也存在類似細(xì)胞程序化死亡的現(xiàn)象。通過

5、顯微觀察，觀測到了衰老東海原甲藻細(xì)胞破裂死亡現(xiàn)象，衰老階段的東海原甲藻細(xì)胞死亡是否也是一種主動地死亡呢?在衰老東海原甲藻表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析中發(fā)現(xiàn)了部分才caspase編碼基因序列，克隆了東海原甲藻caspase編碼基因的全長cDNA序列，序列分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸全長520bp，包含一個258bp的開放閱讀框(open reading flame，0RF)，編碼一個85氨基酸多肽，其5'非翻譯區(qū)長135 bp，3'非翻譯區(qū)長127

6、bp，并在其3'非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)一個poly(A)+加尾信號(AATAA)。以β-actin為參照基因，我們進(jìn)一步對其在衰老東海原甲藻細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)：在各個衰老階段的東海原甲藻細(xì)胞中存在Caspase基因表達(dá)，并且其表達(dá)存在顯著差異。在開始階段，Caspase基因的表達(dá)量逐漸增加，到第6天時，達(dá)到最大值0.689(是第0天的19倍)；之后，其表達(dá)量逐漸降低，到第9天時，不能檢測到任何基因的表達(dá)。結(jié)果表明衰老東海原甲藻細(xì)胞的