苯甲酸脅迫下人參基因差異表達(dá)分析及響應(yīng)基因WRKY7的克隆與轉(zhuǎn)化.pdf

1、人參(Panax ginseng C.A.Mey.)為五加科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材。其連作障礙問題十分突出，使人參不論從表觀品質(zhì)還是內(nèi)在品質(zhì)上都顯著下降，嚴(yán)重時(shí)甚至造成絕收。化感自毒物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致土壤微生物種群結(jié)構(gòu)、理化性狀變化，被認(rèn)為是引起連作障礙的主要原因之一。目前針對(duì)在自毒物質(zhì)脅迫下人參基因差異表達(dá)的研究較少。本課題在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析化感自毒物質(zhì)苯甲酸脅迫下人參基因差異表達(dá)的基礎(chǔ)上，根據(jù)測(cè)序結(jié)果結(jié)合功能注釋信息分析了人

2、參生理指標(biāo)相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)情況，從中挑選出1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因克隆全長(zhǎng)，對(duì)該基因進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析并將其轉(zhuǎn)入到模式植物擬南芥中，為進(jìn)一步研究人參響應(yīng)化感自毒物質(zhì)脅迫的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。主要成果如下：
　　(1)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究了苯甲酸脅迫下人參生理指標(biāo)相關(guān)基因的差異表達(dá)情況，共7個(gè)基因。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其中1個(gè)脯氨酸相關(guān)基因P5CS、1個(gè)丙二醛相關(guān)基因APX、2個(gè)活性氧(ROS)相關(guān)基因及2個(gè)過氧

3、化物酶(POD)基因在苯甲酸脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)。
　　(2)研究了苯甲酸脅迫下人參轉(zhuǎn)錄因子基因的差異表達(dá)情況，共13個(gè)基因。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其中8個(gè)WRKY基因、3個(gè)MYB基因及1個(gè)AP2/ERF基因在苯甲酸脅迫后顯著上調(diào)表達(dá);1個(gè)MYB基因下調(diào)表達(dá)。
　　(3)根據(jù)苯甲酸脅迫下的人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，利用RT-PCR法獲得1條編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因，命名為WRKY7(GenBank登錄號(hào)：KX255632)，并

4、對(duì)其進(jìn)行TA克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)該基因cDNA全長(zhǎng)1216bp，其開放閱讀框(ORF)為1014bp，編碼337個(gè)氨基酸，有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族第Ⅲ類成員。經(jīng)核苷酸水平同源性分析表明，該基因與西洋參的WRKY6(JF927162.1)、WRKY9(JF927165.1)親緣關(guān)系最近，同源性均為87％。
　　(4)構(gòu)建了pCAMBIA2300-WRKY7過表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入