禾谷鐮刀菌隨機插入突變體的構(gòu)建及其水楊酸代謝途徑關(guān)鍵基因鑒定.pdf

1、赤霉病是小麥的重要病害之一，其主要致病菌是禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum Schwabe）。目前禾谷鐮刀菌誘發(fā)赤霉病的機理尚不清楚。對禾谷鐮刀菌的功能基因進(jìn)行研究，有助于科學(xué)認(rèn)識禾谷鐮刀菌的致病機理，為赤霉病的防治奠定分子基礎(chǔ)。為此本文主要做了以下研究:
　　1.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建禾谷鐮刀菌的T-DNA隨機插入突變體。通過對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，每轉(zhuǎn)化106個分生孢子得到70-80個T-DNA隨機插入

2、突變體。經(jīng)分離純化，得到了365個潮霉素抗性為陽性的突變單株。在SNA培養(yǎng)基上鑒定突變單株的生長狀況，在含水楊酸的SNA培養(yǎng)基上鑒定其生長狀況，在溫室接種小麥鑒定其致病力。結(jié)果得到6株突變體在普通SNA培養(yǎng)基上生長緩慢;8株在普通SNA培養(yǎng)基上生長產(chǎn)生的色素減少;3株對水楊酸敏感，在含2.0 mM水楊酸的SNA培養(yǎng)基中無法生長;2株在溫室接種小麥后致病力明顯下降。其中，△Ma334在普通SNA培養(yǎng)基上同時表現(xiàn)為生長緩慢和菌落白化，△Ma

3、208同時表現(xiàn)為在普通SNA培養(yǎng)基上生長緩慢和在含2.0 mM水楊酸的SNA培養(yǎng)基中無法生長，△Ma39則同時表現(xiàn)為在普通SNA培養(yǎng)基上生長緩慢和接種小麥后致病力明顯下降。
　　對以上16株突變體基因組進(jìn)行PCR，結(jié)果表明這16株突變體單株均含有潮霉素抗性基因(HPH)序列。以T-DNA右翼序列設(shè)計的3個嵌套引物和2個簡并引物對這些突變體基因組進(jìn)行巢氏PCR(TAIL-PCR)，對擴增得到DNA片段進(jìn)行克隆測序。得到4個突變體的T

4、-DNA側(cè)翼序列。將這些側(cè)翼序列與禾谷鐮刀菌的基因組序列進(jìn)行比對，獲得了如下信息:
　　T-DNA在△Ma39的插入位點位于禾谷鐮刀菌supercontig3.4的542464 bp處，位于基因FGSG_06605.3的中間。該基因可能編碼β-葡萄糖苷酶的前體蛋白，與葡萄糖的分解相關(guān)。T-DNA的插入可能使基因FGSG_06605.3無法正常表達(dá)，導(dǎo)致△Ma39在普通SNA培養(yǎng)基中生長緩慢，及接種小麥麥穗后致病力明顯下降。

5、　　T-DNA在△Ma247的插入位點位于禾谷鐮刀菌supercontig3.6的1547302 bp處，位于基因FGSG_13581.3的中間。該基因編碼一個未知蛋白，T-DNA的插入可能使基因FGSG_13581.3無法正常表達(dá)，導(dǎo)致△Ma247在普通SNA培養(yǎng)基中生長時菌落白化。
　　T-DNA在△Ma256的插入位點位于禾谷鐮刀菌supercontig3.3的2133337 bp處，位于FGSG12730.3上游819bp

6、處和FGSG_05397.3上游1339 bp處。這兩個基因編碼的均為未知蛋白。T-DNA的插入可能使FGSG_12730.3和FGSG_05397.3無法正常表達(dá)，導(dǎo)致△Ma256在普通SNA培養(yǎng)基中生長時菌落白化。
　　T-DNA在△Ma319的插入位點位于禾谷鐮刀菌supercontig3.6的1360744 bp處，位于基因FGSG_09387.3的下游。根據(jù)Blastx的結(jié)果，該插入位點位于一個非典型蛋白中間，可能使該蛋

7、白不能正常表達(dá)，從而導(dǎo)致△Ma319在普通SNA培養(yǎng)基上生長緩慢。
　　2.以葡萄糖為唯一碳源的改良SNA培養(yǎng)基為對照，以水楊酸為唯一碳源的改良SNA培養(yǎng)基培養(yǎng)禾谷鐮刀菌Fg180378。提取菌絲mRNA，利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)檢測基因表達(dá)。結(jié)果表明，有173個基因的表達(dá)存在顯著差異。其中86個基因上調(diào)表達(dá)，87個基因下調(diào)表達(dá)。與之前的研究比較，進(jìn)一步驗證了FGSG09063在水楊酸代謝過程中的重要性;發(fā)現(xiàn)了一些與芳