食管鱗癌中腫瘤相關(guān)基因的甲基化研究.pdf

1、第一部分食管鱗癌甲基化譜及其作為腫瘤標志物的研究
　　 背景:
　　 近年來DNA高度甲基化被公認為是食管鱗癌發(fā)病的最常見分子機制之一。然而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在參與這種分子異常改變中的重要作用和多基因的高度甲基化作為新型腫瘤標志物的潛在可能性仍然不清楚。
　　 方法:
　　 本文通過甲基化特異性PCR研究了47例食管鱗癌患者癌與癌旁正常組織中12個腫瘤相關(guān)基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài),并通過亞硫酸鹽測序的方法進

2、一步證實甲基化CpG位點的存在。為了評價DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA高度甲基化譜的關(guān)系,通過熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析了三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(DNMT1,DNMT3a和DNMT3b)的mRNA表達水平,并通過免疫組織化學進一步分析了DNMT3b蛋白表達水平。為了探討腫瘤相關(guān)基因甲基化作為腫瘤標志物的可能性,通過甲基化熒光定量PCR分析了45例食管鱗癌患人和15例正常對照健康人中5個高甲基化基因(p16,CDH1,RASSF1A,DAPK,

3、和RAR-β)在血清游離DNA中的甲基化水平。
　　 結(jié)果:
　　 97.9％(46/47)的食管鱗癌組織至少存在一個基因發(fā)生高度甲基化。在腫瘤組織中單個基因的甲基化頻率依次為:RAR-β為46.8％；DAPK為46.8％；p16為44.7％；CDH1為42.6％；RASSF1A為14.9％；p14為14.9％;TIMP-3為14.9％；APC為12.8％；MGMT為12.8％；FHIT為6.4％；GSTP1和ADAM2

4、3為0％,而在癌旁正常組織中未發(fā)現(xiàn)高的甲基化頻率。多個基因的甲基化與病人一些臨床病理特征顯著相關(guān)。在腫瘤組織中,DNMT3b的mRNA和蛋白表達水平顯著高于癌旁正常組織(P=0.005和P<0.001),同時DNMT3b的mRNA過表達顯著與多基因的高度甲基化顯著相關(guān)(P=0.021)。當同時考慮DNMT1和DNMT3b過表達時,這種顯著相關(guān)性更強(P=0.008),并且與腫瘤早期階段(pT1-2)顯著相關(guān)(P=0.01)。相對正常對照

5、健康人,在食管鱗癌患者血清游離DNA中同樣也發(fā)生了異常的高甲基化水平(CDH1為84.4％和20％,DAPK為73.3％和13.3％,RASSF1A為62.2％和6.7％,RAR-β為26.7％和13.3％,p16為6.7％和0％)。當2個及更多的高甲基化基因進行聯(lián)合分析時,這種甲基化腫瘤標志物的靈敏度和特異性明顯提高,具有較好的潛在診斷價值(RDC AUC0.911,82.2％的靈敏度和100％的特異性)。
　　 結(jié)論:

6、>　　 多個腫瘤相關(guān)基因的高甲基化可能參與了食管鱗癌的發(fā)生和發(fā)展,并且這種異常甲基化調(diào)控可能受上調(diào)表達的DNMT3b所介導(dǎo)。另外,食管鱗癌患者血清DNA中多個腫瘤相關(guān)基因的甲基化將可能作為一種新型的腫瘤標志物用于食管鱗癌的篩查和早期診斷。
　　 第二部分分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族基因(SFRPs)甲基化與食管鱗癌相關(guān)性研究
　　 背景:
　　 分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族(SFRPs)包括五種分泌型糖蛋白,并作為一類拮抗

7、物參與Wnt信號調(diào)節(jié)。經(jīng)典Wnt信號通路的異常激活是人類多種腫瘤的一個重要特征。因此Wnt通路負調(diào)節(jié)物SFRPs蛋白的異常改變可能參與了腫瘤的發(fā)生。在多種腫瘤中SFRPs基因的異常甲基化和表達沉默常發(fā)生,但在食管鱗癌中的研究尚未見報道。
　　 方法:
　　 本文通過甲基化特異性PCR分析了47例食管鱗癌患者癌與癌旁正常組織中SFRP家族基因4個成員(SFRP1,2,4和5)的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),同時通過熒光定量反轉(zhuǎn)錄PC

8、R評價了它們的mRNA表達水平。其次,實驗通過甲基化特異性PCR和熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-雜氮-2-脫氧胞苷)和組蛋白去乙?；种苿?曲古菌素A)處理和未處理的食管鱗癌細胞系中SFRPs基因的甲基化狀態(tài)和mRNA表達水平。通過亞硫酸鹽基因組測序分析了SFRP1和SFRP5啟動子區(qū)的甲基化水平。最后,實驗分析了食管鱗癌組織中SFRPs甲基化與DNMTs上調(diào)表達的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 47

9、例食管鱗癌患者腫瘤組織中SFRP1,SFRP2,SFRP4和SFRP5甲基化頻率依次為51.1％,61.7％,46.8％和44.7％,而在對應(yīng)癌旁正常組織中的甲基化頻率依次為23.4％,55.3％,34.096和25.5％,僅SFRP1的高甲基化頻率在兩組中存在顯著差異(P=0.01)。SFRP1的甲基化頻率在小于5cm的腫瘤組織中顯著更高(P<0.0001)。相對于癌旁正常組織,四個SFRPs基因中只有SFRP1在腫瘤組織中mRNA表

10、達顯著下調(diào)(P=0.026)。食管鱗癌細胞系經(jīng)去甲基化藥物和去乙酰化抑制劑聯(lián)合處理后,沉默表達的SFRP1基因又重新恢復(fù)了表達。亞硫酸鹽基因組測序進一步證實了在食管鱗癌組織和細胞系中SFRP1啟動子區(qū)存在密集的甲基化位點。本研究并未發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組中SFRPs的異常甲基化與DNMTs的mRNA表達上調(diào)顯著相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 SFRPs基因的高甲基化是食管鱗癌中一個常見的早期分子異常改變。在SFRPs家族基因中,SF

11、RP1基因是食管鱗癌發(fā)生中一個主要的高頻率表觀失活靶點。異常的啟動子甲基化導(dǎo)致SFRP1基因表達的功能性沉默。研究結(jié)果也提示SFRP1基因的甲基化沉默也許是食管鱗癌中Wnt信號通路異常激活的重要機制之一,并且可能作為食管鱗癌的一個標志物用于臨床的診治。
　　 第三部分食管鱗癌全基因組等位基因表達譜研究
　　 背景:
　　 等位基因特異表達(ASE)是表型差異的重要機制之一,并且這種現(xiàn)象存在于腫瘤細胞中。盡管X染色

12、體失活和基因組印記這些染色體等位基因特異表達典型例子的生物學功能已經(jīng)被熟知,但在人類食管鱗癌中全基因組的等位基因表達譜分析還沒有被研究。
　　 方法:
　　 本文結(jié)合了高通量芯片分析和高效RNA混合池策略的SNP—MaP(SNP Microarraysand Pooling)方法,利用Affymetrix Genome-wide Human SNP Array6.0對9例食管鱗癌與癌旁對照正常組織標本進行了全基因等位基因

13、表達分析。通過基因群富集分析對差異表達基因進行了功能分類。同時通過甲基化特異性PCR對一些表達顯著差異的基因進行了甲基化分析,并比較其ASE差異與甲基化的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 相對癌旁正常組織,食管鱗癌組織中基因組整體表達模式呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢。其中1526個基因發(fā)生了顯著表達下調(diào),463個基因則顯著表達上調(diào)(P<0.01)。在下調(diào)的基因中,47.2％(721/1526)的基因存在顯著ASE差異。表達下調(diào)基因主要分布在

14、腺嘌呤核苷酸和鈣離子結(jié)合基因、分子信號傳導(dǎo)膜受體活性基因、細胞內(nèi)質(zhì)膜桂關(guān)基因和神經(jīng)系統(tǒng)認知與感應(yīng)過程相關(guān)基因四類功能基因中。一些表達下調(diào)基因(APC,MGMT,PAR-β,CDKN2A和SFRP4)在腫瘤組織中都存在不同程度的甲基化(范圍:11.1％-66.7％),同時這些基因存在顯著ASE差異或強的趨勢。
　　 結(jié)論:
　　 本研究證實Affymetrix Human SNP芯片和高效混合池策略結(jié)合的SNP—MaP能銹