一種新型鈣調素結合蛋白-金屬蛋白酶在龍須菜高溫脅迫中的表達模式研究.pdf

1、龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)是一種重要的產瓊膠經濟海藻,原產于山東和遼寧,在我國已成為繼海帶和紫菜后的第三大栽培海藻。隨著龍須菜栽培業(yè)的不斷發(fā)展,對龍須菜種質提出了更高的要求,研究者們先后選育出耐熱品種981和07-2,使得龍須菜品質得到了不斷改良,其耐高溫性能也不斷提高,帶來了巨大的經濟效益和社會生態(tài)效益。然而,在龍須菜大規(guī)模栽培中,這兩個耐高溫品系也出現(xiàn)了種質退化現(xiàn)象,為此,迫切需要研究龍須菜在高溫脅迫

2、下的響應機制,為選育性狀優(yōu)良、耐高溫性強的龍須菜新品系奠定基礎。
　　實驗室前期通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選高溫脅迫條件下鈣調素(CaM)結合蛋白,得到了金屬蛋白酶(metalloproteinase of Gracilaria lemaneiformis, GlMP)的表達序列標簽,表明金屬蛋白酶可能是龍須菜CaM信號傳導途徑中的一員,在龍須菜響應高溫脅迫中發(fā)揮作用。本論文在此基礎上,首次克隆龍須菜的GlMP基因,并研究其在高溫脅迫下

3、的表達模式,為探討龍須菜對高溫脅迫下的信號傳導途徑打下基礎,并為龍須菜耐高溫品系的選育提供可用的基因信息。
　　本研究以野生型、981和07-2三種龍須菜為實驗材料,通過RACE技術和Genome Walking方法,首次克隆了龍須菜中GlMP基因的cDNA和DNA序列全長。結果表明,克隆得到的龍須菜GlMP cDNA全長546bp,包括462bp的開放閱讀框,36bp的5’ UTR以及48bp的3’ UTR。開放閱讀框編碼153

4、個氨基酸,其中包括金屬蛋白酶的Zn2+保守結構域HEXXH。克隆得到的龍須菜GlMP基因全長1123bp,其中包含5’端側翼序列542bp,以及一個長約71bp的內含子。比較發(fā)現(xiàn)野生型、981和07-2三種龍須菜中GlMP的序列無差異。Southern雜交結果表明無論是野生型、981還是07-2,基因組中均含有2個拷貝GlMP基因。利用酵母雙雜交技術檢測表明,GlMP可以與CaM相互作用,是一種鈣調素結合蛋白。
　　通過比較3種龍

5、須菜中GlMP和CaM的表達水平發(fā)現(xiàn),野生型龍須菜中GlMP的表達水平高于981和07-2龍須菜,981龍須菜中CaM的表達高于其余2種品系,而3種龍須菜的耐高溫性能是07-2>981>野生型,可見耐高溫性能并不是由單一因子表達水平決定的,可能與多種耐高溫因子及它們之間的協(xié)同作用有關。龍須菜中GlMP和CaM均在32°C表達高于28°C,表明它們都可以對高溫脅迫積極響應。
　　此外,本論文以CaM為誘餌,通過酵母雙雜交篩選到39條

6、CaM結合蛋白的基因,經生物信息學分析發(fā)現(xiàn),這些基因多為蛋白酶類,參與各種水解、氧化還原、脫羧等反應,并且其蛋白質的二級結構符合鈣調素結合域(CaMBD)的特點。根據(jù)鈣調素結合蛋白(CaMBP)數(shù)據(jù)庫分析本研究獲得的GlMP氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)其82-123位具有 CaMBD結構域的特點,推測為鈣調素結合區(qū)域,為了驗證該區(qū)域,本研究將GlMP的氨基酸序列分為4部分-CaMBD部分(表示為Most),CaMBD上游部分(表示為Front),

7、CaMBD下游部分(表示為Last)和全長GlMP(表示為Whole),分別將這四部分與CaM采用酵母雙雜交進行驗證,結果顯示Most和Whole部分菌落變藍,而Front和Last部分沒有變藍,表明軟件預測的GlMP中82-123位的氨基酸區(qū)域是CaMBD,GlMP是一種鈣調素結合蛋白。
　　本研究為探討龍須菜的CaM信號系統(tǒng)在高溫脅迫下的作用元件和作用過程,并為進一步揭示龍須菜的高溫脅迫分子響應機理以及耐高溫新品種的選育奠定基