siRNA抑制ZNF139前后胃癌BGC823細胞差異蛋白質的篩選與鑒定.pdf

1、目的:胃癌是全球第二大癌癥致死性疾病，尤以中國等其他東亞國家高發(fā)。盡管世界各國的學者在對胃癌的發(fā)生發(fā)展和診斷治療的研究中，已經發(fā)現許多胃癌相關基因和蛋白，但是仍然沒有全面的揭示胃黏膜細胞的惡化、增殖凋亡、侵襲轉移等機制。有研究表明，人鋅指蛋白(zincfingerprotein，ZNF)家族基因在多種腫瘤如乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌等的發(fā)生和腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移以及多藥耐藥有關。鋅指蛋白139(zincfingerprotein1

2、39，ZNF139)基因編碼表達鋅指蛋白亞科KRAB的轉錄調節(jié)蛋白，該蛋白含有重復的與保守序列相連接的Cys2-His2(C2H2)鋅指結構域，而這種結構被認為與特異的DNA調控基因的轉錄、參與RNA轉錄后調控、介導蛋白質間相互作用。本實驗室前期研究發(fā)現ZNF139的異常表達與胃癌的分化密切相關，但ZNF139與胃癌的發(fā)生發(fā)展的具體機制之間的關系尚不清楚。本實驗用ZNF139特異性siRNA轉染人胃癌細胞株BGC823，研究被抑制后ZN

3、F139基因mRNA的表達，并依靠蛋白質組學技術進一步探討ZNF139基因被抑制前后胃癌細胞差異表達的蛋白質及其生物學功能。
　　 方法:
　　 1.用含有ZNF139特異性siRNA的質粒轉染胃癌細胞BGC823抑制ZNF139基因的表達，應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測轉染前后BGC823細胞內ZNF139mRNA表達變化情況。
　　 2.培養(yǎng)胃癌細胞株BGC823，通過siRNA轉染胃癌細胞抑

4、制ZNF139基因的表達，應用雙向差異凝膠電泳分離、篩選轉染前后BGC823細胞內差異表達的蛋白質，然后用液相質譜—色譜技術鑒定并用生物信息數據庫分類相關蛋白質。
　　 3.采用蛋白質印跡技術（Westernblot）驗證鑒定出的蛋白質在轉染前后胃癌細胞中表達量與蛋白質組學方法結果是否一致。
　　 結果:
　　 1.siRNA抑制ZNF139前后胃癌細胞ZNF139mRNA表達發(fā)現:陽性組的ZNF139mRNA的

5、相對表達量(15.6±1.61)×10-5顯著低于空白對照組（68.8×±4.05）×10-5，且二者之間差異有統(tǒng)計學意義(P=9.1×10-10＜0.05);空白對照組與陰性對照組ZNF139mRNA的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.491＞0.05)。
　　 2.胃癌細胞雙向差異凝膠電泳圖譜中差異蛋白質點的分析:應用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware選取了8個具有顯著表達差異的蛋白質點

6、，并用Ettanspotpicker系統(tǒng)進行挖點。這些蛋白質在陽性組胃癌細胞蛋白樣品中表達上調的有5個，表達下調的有3個。
　　 3.對差異蛋白的質譜鑒定和數據庫檢索發(fā)現:在上述8個差異蛋白質點中有7個被鑒定為有意義的蛋白質分別為:開關相關蛋白70、遠上游元件結合蛋白1、熱休克蛋白60、膜聯蛋白A7、小泛素樣調節(jié)蛋白1、含伴侶蛋白的少尾復合體蛋白1和膜聯蛋白A2;另外1個未能鑒定出有意義的蛋白質。對比胃癌細胞蛋白圖譜發(fā)現:開關相

7、關蛋白70、遠上游元件結合蛋白1、熱休克蛋白60、小泛素樣調節(jié)蛋白1在陽性組胃癌細胞中表達上調，而膜聯蛋白A7、含伴侶蛋白的少尾復合體蛋白1、膜聯蛋白A2則在陽性組胃癌細胞中表達下調。
　　 4.應用Westernblot法驗證差異蛋白的表達水平發(fā)現:遠上游結合蛋白1在陽性組胃癌細胞中均表達上調，膜聯蛋白A7和膜聯蛋白A2在陽性組胃癌細胞中均表達下調，陽性組與空白對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果與蛋白質組學方法所得結

8、果吻合。
　　 結論:
　　 1.ZNF139mRNA的表達在陽性組BGC823細胞中表達明顯降低，說明siRNA抑制了ZNF139基因的轉錄。
　　 2.從siRNA抑制ZNF139前后的胃癌細胞總蛋白中分離出8個差異蛋白質點且其中7個被鑒定為有意義的蛋白，說明ZNF139基因的表達被抑制后胃癌細胞蛋白表達具有差異性。
　　 3.siRNA抑制ZNF139胃癌細胞的蛋白質中:開關相關蛋白70、遠上游元件

9、結合蛋白1、熱休克蛋白60、小泛素樣調節(jié)蛋白1表達上調，而膜聯蛋白A7、含伴侶蛋白的少尾復合體蛋白1膜聯蛋白A2表達下調，提示這些蛋白的表達與ZNF139基因的表達相關;上述蛋白與胃癌的增殖、凋亡、侵襲、轉移等有關，進而說明ZNF139可能直接或間接與胃癌細胞的上述生物學行為有關。
　　 4.通過蛋白印跡法檢驗鑒定出的蛋白質在轉染前后胃癌細胞中的表達，結果發(fā)現均與蛋白質組學鑒定結果相符合。這說明本研究鑒定出的蛋白質與ZNF139