siRNA干擾胃癌BGC-823細胞中polβ表達的初步研究.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文siRNA干擾胃癌BGC823細胞中polβ表達的初步研究姓名：王蕾申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：趙國強董子明20070501鄭州人學2007屆碩士研究生畢業(yè)論文中文摘要(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)現(xiàn)象。該技術能夠有效使轉錄后基因沉默，甚至可以代替基因敲除，是目前研究基因調控的重要手段。本研究構建polB基因靶向的siRNA表達載體，轉染到胃癌細

2、胞株BGC一823中，檢測該細胞中polB基因表達的沉默效果，同時初步觀察polB基因表達抑制后對細胞生物學行為的影響。實驗方法利用Takara、Ambion和PromegasiRNA靶序列分析設計系統(tǒng)，掃描人polBcDNA編碼序列(M13140)，依據(jù)siRNA靶序列設計原則，經(jīng)BLAST同源性分析，選擇確定19個堿基的siRNA靶序列。分別合成2對靶向pol8siRNA序列和一對無關siRNA的DNA單鏈，退火成雙鏈DNA，用Ba

3、mHl和XhoI雙酶切siRNA表達載體pRNAT—U61；將具有相同酶切位點的發(fā)卡樣siRNA片段克隆入siRNA表達載體pRNAT—u61中；利用PCR擴增法篩選鑒定重組子pRNAT—U6卜sipolBl、pRNAT—U6卜sipolB2、pRNAT—U6卜Con；對插入序列進行DNA序列分析。將siRNA表達載體pRNAT—U6卜sipolB1、pRNAT—U6卜sipolB2、pRNAT—u61Con轉入人胃癌細胞系BGC一82

4、3中，同時設空載體對照組(轉染空載體pRNAT—U61)和空白對照組(未轉染)；用熒光定量PCR方法檢測各組細胞polpmRNA表達水平；用流式細胞術檢測各組細胞周期及細胞增殖率，并將各組的細胞注射裸鼠皮下組織以觀察腫瘤細胞體內的增殖情況，最后用熒光定量PCR檢測各組腫瘤組織中polBmRNA表達水平。實驗結果1初步篩選得到27個后選片段，對這些候選序列通過同源序列檢索和進一步優(yōu)選，最終確定5’274—292位(GAACGTGAGCCA

5、AGCTATC)和661—679位(GATTCGGCAGGATGATACG)為siRNA靶序列，并選擇一無關對照的發(fā)卡樣DNA序列。2siRNA發(fā)卡DNA的退火后三個退火產(chǎn)物sipolB1、sipolB2和Con，電泳可見三條明亮條帶，位于約70bp處，與設計完全一致。3成功構建重組子pRNAT—U6卜sipolB1、pRNAT—U6卜sipolB2和pRNAT—U61Con，測序分析其序列與設計完全一致。4轉染48小時后用熒光顯微鏡觀