中肋骨條藻增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)量與生長(zhǎng)關(guān)系的研究.pdf

1、對(duì)浮游藻現(xiàn)場(chǎng)生長(zhǎng)率等基本生理生態(tài)學(xué)參數(shù)的測(cè)定，是估算浮游藻類生產(chǎn)力、研究浮游藻種群變遷、構(gòu)建生態(tài)動(dòng)力學(xué)模型乃至赤潮預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)，但目前還缺乏一種準(zhǔn)確估算單一種類浮游藻現(xiàn)場(chǎng)生長(zhǎng)率的技術(shù)方法。近年來(lái)，國(guó)際上對(duì)細(xì)胞周期標(biāo)志物的研究顯示，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)可能在浮游藻生長(zhǎng)率研究中有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，這為藻類生長(zhǎng)率的估算提供了新的研究視角。 本研究以中國(guó)近海常見(jiàn)

2、的赤潮藻--中肋骨條藻(Skeletonema costatum)為研究對(duì)象，建立了有效提取中肋骨條藻RNA的方法，進(jìn)而通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲得了其PCNA基因的部分序列，首次克隆測(cè)序得到了714bp的中肋骨條藻細(xì)胞色素b(cytochrome b，Cytb)基因序列，并分別建立了PCNA系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)和Cyt系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)。進(jìn)一步地，根據(jù)得到的PCNA與Cyt b基因序列，分別設(shè)計(jì)了符合實(shí)時(shí)熒

3、光定量PCR(RFQ-PCR)檢測(cè)要求的引物和TaqMan探針，建立了檢測(cè)中肋骨條藻PCNA與Cyt b基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程分別為：對(duì)PCNA，y=-3.055x+41.093(r=0.999,其中x為細(xì)胞數(shù)對(duì)數(shù)值，y為C<,T>值，R為相關(guān)系數(shù))：對(duì)Cyt b，y=-4.0x+44.96(r= 0.997)。以16種藻為參照藻，對(duì)所設(shè)計(jì)PCNA的RFQ-PCR引物的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證，并通過(guò)對(duì)已知濃度樣品的檢測(cè)

4、證明了所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。 以上述建立的系列試驗(yàn)研究方法為基礎(chǔ)，系統(tǒng)研究了中肋骨條藻生長(zhǎng)率與增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)量之間的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平均單細(xì)胞中PCNA表達(dá)量在培養(yǎng)的不同階段變化很大，且變化趨勢(shì)與生長(zhǎng)率表現(xiàn)出良好的一致性，說(shuō)明PCNA表達(dá)量與細(xì)胞分裂密切相關(guān)，體現(xiàn)了其作為細(xì)胞增殖指標(biāo)的潛能；而Cyt b基因表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)量變化很小，說(shuō)明Cyt b基因是一個(gè)潛在的良好的內(nèi)參基因。基于此，本研究提出可以PCNA為目的基