禽白血病病毒p27抗原不同檢測(cè)方法在禽白血病凈化中的應(yīng)用與比較.pdf

1、禽白血?。ˋvian Leukemia,AL）是我國(guó)雞群中流行最為廣泛的腫瘤性疾病之一。其病原體是禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）。自1908年首次報(bào)道禽白血病以來(lái)，世界各地不斷有該病的報(bào)道流行?，F(xiàn)今，我國(guó)雞群中普遍存在ALV感染，尤其在我國(guó)地方品種雞中感染率較高，對(duì)地方品種資源造成嚴(yán)重威脅的同時(shí)，也給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，因而對(duì)ALV的監(jiān)測(cè)和凈化越來(lái)越受到業(yè)界的關(guān)注。目前，對(duì)待檢雞群進(jìn)行病毒分離或

2、者通過檢測(cè)不同樣品中p27抗原確定陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)而淘汰是ALV凈化過程中不可或缺的重要措施。在凈化的過程中，選擇何種樣品和何種檢測(cè)手段來(lái)確定感染的雞只進(jìn)行淘汰是實(shí)施凈化進(jìn)而精簡(jiǎn)凈化程序的核心，本研究不僅對(duì)應(yīng)用ALV-p27抗原的單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光（IFA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行了對(duì)比，也對(duì)感染雞群中同一樣品的病毒分離及其泄殖腔棉拭子或蛋清p27抗原檢測(cè)進(jìn)行了系統(tǒng)對(duì)比，以期為科學(xué)設(shè)定ALV凈化檢測(cè)規(guī)程提供技術(shù)指導(dǎo)。

3、>　　1．不同類型雞其泄殖腔棉拭子或蛋清p27抗原檢測(cè)與病毒分離相關(guān)性分析
　　為探討泄殖腔棉拭子或種蛋中ALV-p27抗原檢測(cè)與病毒分離檢測(cè)之間的相關(guān)性，本研究對(duì)幾種不同類型雞群，包括不同方式人工接種A亞群ALV的SPF雞、完成ALV凈化的進(jìn)口祖代肉雞以及處于ALV凈化過程中的綠殼蛋雞、瑯琊雞、仙居雞、蘆花雞4個(gè)地方品系雞，對(duì)其進(jìn)行一一編號(hào)后分別對(duì)應(yīng)采集泄殖腔棉拭子或蛋清用 ELISA抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)p27抗原，同時(shí)無(wú)菌采集抗

4、凝血接種DF-1細(xì)胞進(jìn)行ALV的分離鑒定，來(lái)觀察和比較泄殖腔棉拭子或種蛋中ALV-p27抗原檢測(cè)與病毒分離檢測(cè)之間的吻合率。結(jié)果顯示，人工感染A亞群ALV的SPF雞群泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測(cè)與病毒分離有很高的吻合率，相對(duì)于病毒分離法，119次泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測(cè)中出現(xiàn)有1例假陽(yáng)性和3例假陰性；從美國(guó)進(jìn)口的200只祖代肉雞3次采血DF1細(xì)胞病毒分離結(jié)果均為陰性，而泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原陽(yáng)性率依次為4.0％（

5、8/200），2.97%（5/168）和2.61%（4/153），平均假陽(yáng)性率為3.3%（17/521）。相對(duì)于病毒分離法，正在實(shí)施ALV凈化的不同遺傳背景地方品系雞泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測(cè)的假陽(yáng)性率高達(dá)93.2%~100%，還有一定比例假陰性（1/9，1/4，1/3）。本研究大量一一對(duì)應(yīng)比較的數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于血漿病毒分離法，不同類型雞的泄殖腔棉拭子p27檢測(cè)法不僅有很高的假陽(yáng)性率，還有一定比例漏檢率。在種雞場(chǎng)的ALV凈化過程

6、中考慮到成本，不建議以泄殖腔棉拭子作為檢測(cè)材料。本研究將為我國(guó)雞群中禽白血病的凈化檢測(cè)和臨床鑒別診斷提供參考依據(jù)。
　　2．針對(duì)p27蛋白的ELISA與IFA檢測(cè)不同亞群ALV的靈敏性比較
　　為了評(píng)估以p27單克隆抗體（4F12腹水）進(jìn)行的IFA檢測(cè)與p27抗原的ELISA檢測(cè)的靈敏性，本研究將A亞群SDAU14A1株、B亞群SDAU09C2株、J亞群733株及K亞群JS11C1株和JS11C3株四種不同ALV亞群五個(gè)毒株

7、分別以細(xì)胞維持液做10倍有限梯度稀釋（10-1~10-8），每個(gè)稀釋度各取100μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的一列DF-1細(xì)胞共8個(gè)孔，接種2h后換液維持。每個(gè)毒株做3個(gè)重復(fù)，分別在3、6、9d對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清p27抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)，細(xì)胞固定進(jìn)行IFA檢測(cè)，Reed-Muench法計(jì)算兩種方法測(cè)定的病毒TCID50。結(jié)果顯示，IFA檢測(cè)A、B、J、K各個(gè)ALV亞群感染的DF-1細(xì)胞時(shí)，熒光顯微鏡下均出現(xiàn)特異性綠色熒光信號(hào)，而對(duì)照組無(wú)熒

8、光顯現(xiàn)；與ELISA檢測(cè)結(jié)果相比，IFA檢測(cè)不同ALV亞群時(shí)均可檢測(cè)到更高的病毒稀釋度和更多的陽(yáng)性細(xì)胞孔；采用Reed-Muench法計(jì)算所得ELISA和IFA兩種檢測(cè)方法測(cè)定的各個(gè)病毒毒株TCID50分別是SDAU14A1株10-4.33 TCID50/0.1 mL與10-4.80 TCID50/0.1 mL、SDAU09C2株10-4.50 TCID50/0.1 mL與10-5.43 TCID50/0.1 mL、733株10-5.2

9、0 TCID50/0.1 mL與10-5.43 TCID50/0.1 mL、JS11C1株10-4.80 TCID50/0.1 mL與10-5.20 TCID50/0.1 mL、JS11C3株10-4.67 TCID50/0.1 mL與10-5.33 TCID50/0.1 mL，可以看出，IFA測(cè)定的病毒TCID50均明顯高于ELISA。本研究結(jié)果證明p27單克隆抗體4F12腹水能夠特異性結(jié)合A、B、J、K亞群ALV p27蛋白，以其進(jìn)