大黃素衍生物對(duì)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞及高致瘤K562細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的體內(nèi)外作用及機(jī)制研究.pdf

1、慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性克隆增殖性疾病。
　　大黃素(emodin)，化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6甲基蒽醌，是從掌葉大黃的根莖中提取出的有效成分，屬天然的蒽醌類化合物，具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用。近年來(lái)大黃素的抗腫瘤活性受到了人們的關(guān)注。本課題組應(yīng)用大黃素抗白血病研究已取得階段性結(jié)果，我們的研究顯示大黃素能夠有效抑制HL

2、-60、U937、HL-60/ADR、K562及其耐藥細(xì)胞株增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該過(guò)程可能是多途徑、多分子參與的綜合網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)過(guò)程。我們?cè)诖簏S素基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成、篩選了28種大黃素衍生物，其中，衍生物E35生物活性比大黃素明顯增強(qiáng)。本課題初步探討大黃素衍生物E35對(duì)CML敏感及耐藥細(xì)胞株、白血病原代細(xì)胞及高致瘤K562細(xì)胞裸鼠異種移植瘤的體內(nèi)作用及相關(guān)機(jī)制，研究Bcr-Abl及其下游的信號(hào)分子在其中的表達(dá)改變。
　　課題實(shí)施分為五個(gè)部

3、分，共涉及以下幾方面內(nèi)容：
　　第一，各種大黃素衍生物對(duì)白血病細(xì)胞株的增殖影響，篩選出高效的衍生物E35。
　　方法：合成了28種大黃素衍生物，應(yīng)用MTT法檢測(cè)各種大黃素衍生物對(duì)白血病細(xì)胞株增殖的影響。細(xì)胞株包括Jurkat細(xì)胞、P210Bcr-Abl表達(dá)陽(yáng)性的CML細(xì)胞株K562細(xì)胞、耐IM的K562/G01細(xì)胞。
　　結(jié)果：各種大黃素衍生物對(duì)K562細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞及K562/G01細(xì)胞的增殖抑制作用不同，部

4、分衍生物抗白血病活性較大黃素有所提高。其中，衍生物E35、E36生物活性是大黃素的10倍左右。
　　第二，大黃素衍生物E35對(duì)CML敏感及耐藥細(xì)胞株的增殖凋亡影響及其作用機(jī)制。
　　方法：(1)MTT法、集落形成實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)大黃素衍生物E35對(duì)CML敏感及耐藥細(xì)胞株增殖的影響。細(xì)胞株包括P210Bcr-Abl表達(dá)陽(yáng)性的CML細(xì)胞株K562細(xì)胞、耐IM的K562/G01細(xì)胞。(2)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：Annexin V FITC/PI

5、、DNA Ladder、DAPI分析等。(3)RT-PCR、RQ-PCR：檢測(cè)bcl-2、bax、c-myc、mcl-1、hTERT等凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平及bcr-abl基因表達(dá)改變。(4)Western Blot：檢測(cè)P210Bcr-Abl、磷酸化 P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)及其下游信號(hào)通路的 Crkl、p-Crkl、PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號(hào)分子表達(dá)變化，并檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspa

6、se3、Caspase8、Caspase9、PARP、hTERT等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化。K562/G01細(xì)胞同時(shí)檢測(cè)核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM、B23、NO38或 NPM1)和核仁素(C23)等表達(dá)變化。同時(shí)與PI3K/Akt/mTOR、MAPK特異性抑制劑干預(yù)組(LY294002、Rapamycin、PD98059)進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：(1)大黃素衍生物E35對(duì)CML細(xì)胞株增殖抑制作用：①E35以時(shí)間

7、和劑量依賴方式抑制 K562細(xì)胞、K562/G01細(xì)胞增殖，對(duì)兩種細(xì)胞株的48h IC50值接近，MTT法檢測(cè)分別為2.8±0.4μmol/L、3.1±0.3μmol/L。②E35對(duì)K562細(xì)胞、K562/G01細(xì)胞集落形成的IC50平均值分別為0.23μmol/L、0.28μmol/L。(2)E35誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡作用：①E35能夠有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞、K562/G01細(xì)胞凋亡，呈量效關(guān)系。②E35作用后Bcl-2、hTERT、Pr

8、ocaspase3、Procaspase8、Procaspase9等表達(dá)下調(diào)，Caspase3、Caspase9、PARP剪切體及Bax等細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，c-myc基因、蛋白改變不明顯。(3)E35可降低細(xì)胞P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)蛋白水平，抑制其下游的Crkl、PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵信號(hào)活化分子p-Crkl、p-Akt、p-mTOR、p-4E

9、-BP1、p-p70S6k、p-ERK1/2等，下調(diào)方式呈時(shí)間和濃度依賴性，相應(yīng)總蛋白也有不同程度下調(diào)。E35能降低K562/G01細(xì)胞B23、C23、P-gp、GST-π表達(dá)。
　　第三，大黃素衍生物E35對(duì)急性及慢性白血病原代細(xì)胞的增殖凋亡影響及其作用機(jī)制。
　　方法:(1)MTT法檢測(cè)E35對(duì)白血病原代細(xì)胞增殖的影響，以及對(duì)正常細(xì)胞的毒性。其中包括初治、復(fù)發(fā)、難治的急性白血病和CML(慢性期)。正常細(xì)胞包括正常人外周血

10、單個(gè)核細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞株。(2)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：DAPI法檢測(cè)E35對(duì)白血病原代細(xì)胞及正常細(xì)胞凋亡的影響。(3)Western Blot：檢測(cè)Bcl-2、PARP等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化，檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)分子表達(dá)變化。
　　結(jié)果：(1)E35抑制白血病原代細(xì)胞增殖作用呈濃度依賴性，它對(duì)17例白血病患者原代細(xì)胞中位48h IC50值為5.7μmol/L(4.0-8.5μmol/L)

11、。(2)E35抑制細(xì)胞增殖作用具有一定選擇性，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，中位48h IC50為24μmol/L(19-34μmol/L)。(3)E35能夠誘導(dǎo)白血病原代細(xì)胞凋亡，并呈量效關(guān)系，對(duì)LO2誘導(dǎo)凋亡作用不明顯。(4)E35下調(diào)白血病原代細(xì)胞Bcl-2蛋白、PARP前體表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，同時(shí)抑制細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵信號(hào)活化分子p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6k、p

12、-ERK1/2等，相應(yīng)總蛋白表達(dá)也有不同程度下調(diào)，下調(diào)方式呈量效關(guān)系。E35對(duì)難治、復(fù)發(fā)白血病原代細(xì)胞GST-π蛋白表達(dá)也有下調(diào)作用。
　　第四，大黃素衍生物E35對(duì)高致瘤K562細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型作用。
　　方法：(1)檢測(cè)大黃素衍生物E35對(duì)裸鼠的半數(shù)致死劑量(median lethal dose，LD50)。(2)構(gòu)建高致瘤K562細(xì)胞裸鼠異種移植瘤動(dòng)物模型，將荷瘤鼠隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組，100mg/kg IM

13、組，3mg/kgE35組，6mg/kgE35組，12mg/kgE35組。(3)腹腔注射每天兩次，共給藥14d，每3-4天測(cè)量瘤體大小，長(zhǎng)徑×短徑2×0.5計(jì)算腫瘤體積相對(duì)大小。(4)血常規(guī)及肝腎功檢測(cè)；測(cè)量離體瘤塊重量，計(jì)算抑瘤率；裸鼠重要臟器和瘤塊病理組織學(xué)檢查；電鏡觀察瘤組織超微結(jié)構(gòu)。(5)Western Blot檢測(cè)瘤組織蛋白Bcl-2、PARP、P210Bcr-Abl、磷酸化P210Bcr-Abl(p-P210Bcr-Abl)蛋

14、白水平及其下游 PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信號(hào)通路信號(hào)分子表達(dá)。(6)荷瘤鼠生存期觀察：將荷瘤鼠隨機(jī)分為3組，分別為陰性對(duì)照組，100mg/kg IM組及9mg/kgE35組，各組每天給藥一次，共給藥14d，其中，陰性對(duì)照組及9mg/kgE35組為腹腔給藥，100mg/kg IM組為灌胃給藥。比較各組生存率及生存時(shí)間，繪制Kaplan-Meier生存曲線。
　　結(jié)果：(1)E35對(duì)裸鼠的LD50介于60mg/kg～90

15、mg/kg之間。(2)給藥14d后，E35能顯著抑制高致瘤K562細(xì)胞裸鼠異種移植瘤生長(zhǎng)，抑制效應(yīng)呈劑量依賴性，12mg/kg E35組與IM組相比，差異無(wú)顯著性。(3)E35和IM組均能夠誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡，隨著E35作用濃度的升高，凋亡現(xiàn)象越發(fā)明顯。(4)Western Blot檢測(cè)顯示，E35在體內(nèi)能夠下調(diào)p-P210Bcr-Abl、p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6k、p-ERK1/2、p-Crkl以及B

16、cl-2表達(dá)，抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。(5)除6mg/kg E35組和12mg/kg E35組裸鼠給藥14d后WBC下降具有顯著性外，裸鼠一般狀況觀察、肝腎功檢測(cè)及重要臟器組織病理檢測(cè)顯示，E35對(duì)裸鼠無(wú)明顯毒副作用。(6)9mg/kgE35組和100mg/kgIM組荷瘤鼠42d總體生存率(overall survival，OS)、中位生存期(median survival time，MST)及最長(zhǎng)生存時(shí)間(the longest sur

17、vivaltime)與對(duì)照組相比均明顯提高。
　　結(jié)論：(1)在大黃素基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)、合成的部分大黃素衍生物的生物活性較大黃素增強(qiáng)，其中E35較大黃素增強(qiáng)10倍左右。（2）大黃素衍生物E35能夠有效抑制CML細(xì)胞株K562、K562/G01細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)大黃素衍生物E35能夠抑制白血病原代細(xì)胞細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；對(duì)正常細(xì)胞的無(wú)明顯抑制作用。(4)大黃素衍生物E35在體內(nèi)可以有效抑制高致瘤K562細(xì)胞裸鼠異種移植