靜注丙種球蛋白和維生素C對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎治療作用的探討.pdf

1、病毒性心肌炎(VMC)是威脅小兒身體健康的常見疾病，發(fā)病的確切機(jī)制還不是很清楚，認(rèn)為主要是由病毒感染后誘發(fā)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)的心肌損傷。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(EAM)模型是由心肌肌凝蛋白誘導(dǎo)的不用微生物感染的動物心肌炎模型，可以等同于VMC的第二階段，即機(jī)體自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的心肌損傷階段。EAM主要在誘導(dǎo)后15天發(fā)病，它是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂。 靜脈應(yīng)用丙種球蛋白(IVIG)已廣泛應(yīng)用于一些免疫介導(dǎo)疾病的治療。但I(xiàn)

2、VIG的治療機(jī)制還不是很清楚，可能是通過抑制T細(xì)胞、自身抗體介導(dǎo)的損傷及調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞因子分泌。IVIG中包含有很多可以中和病毒的免疫球蛋白，具有抗病毒功能，有研究證實(shí)免疫球蛋白可以在CB3導(dǎo)致的心肌炎急性期提供中和病毒的抗體從而減輕心肌損害；IVIG可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而減輕心肌炎癥；IVIG還可以結(jié)合巨噬細(xì)胞的Fc受體從而阻止抗原的內(nèi)化；有研究顯示免疫球蛋白可以減少血清中兒茶酚胺、IFN-γ、ICAM-1的含量。 Vi

3、tC是一種水溶性的抗氧化劑，可以應(yīng)用于很多疾病中，對細(xì)胞具有保護(hù)作用，在病毒性心肌炎中，發(fā)病機(jī)制與氧化和抗氧化反應(yīng)失衡有著密切的關(guān)系。VitC可能是通過抗氧化和清除自由基的作用減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。 IVIG和VitC治療VMC在臨床和動物研究都有所報(bào)道，但對EAM的作用罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究IVIG和VitC對EAM的作用，探討IVIG和VitC在EAM小鼠中所起的效應(yīng)，以及介導(dǎo)這些效應(yīng)的可能機(jī)制。

4、 材料和方法 1.動物分組：Balb/c小鼠52只(中科院上海動物研究所)，6～8周，雌雄不限，體重16～18克，隨機(jī)分為6組：Ⅰ空白組：8只；Ⅱ?qū)φ战M：8只；Ⅲ1VitC1組：8只；Ⅲ2VitC2組：8只；ⅣIVIG組：10只；ⅤVC+IVIG組：10只。 2.實(shí)驗(yàn)方法和步驟：空白組的小鼠不予任何處理，其余組的小鼠參照NEUN等的EAM模型分別于第0天和第7天在小鼠的雙測腹股溝皮下注射肌凝蛋白，劑量為每次每只100微克

5、。從免疫的當(dāng)天開始即給每只老鼠腹腔注射所給藥物：Ⅱ組小鼠腹腔注射生理鹽水作為對照；Ⅲ1組小鼠腹腔注射VitC，劑量為150mg/kg/d,直到動物被處死；Ⅲ2組的處理同Ⅲ1組，只是VitC劑量增加到300mg/kg/d；Ⅳ組的小鼠腹腔注射IVIG，劑量為1g/kg/d，其它處理同Ⅲ1組；Ⅴ組腹腔注射VitC和IVIG，劑量分別為150mg/kg/d和1g/kg/d，其它處理同上。 3.指標(biāo)檢測：在第一次免疫后的第14天和21天分

6、別稱重，麻醉后處死動物，空白組則在第21天一次性處死作總的對照，每只老鼠進(jìn)行摘眼球取血，1～1.5ml，置于室溫下凝固，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，獲得血清以備測腫瘤壞死因子α(TNF-a)；處死小鼠后立即取心臟、脾臟、腎臟，分別稱重，計(jì)算心臟與體重之比(CR)、脾臟與體重之比(SR)、腎臟與體重之比(RR)；小鼠心臟分為三部分：一部分置于10％甲醛溶液中，用作病理切片和HE染色；一部分置于2.5％戊二醛溶液中，做電鏡觀察；一部分置于液氮中

7、保存，以備做免疫熒光。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±s)表示，組間差異用One-WayANOVA分析，事后兩組之間的比較用最小顯著差法(LSD)；兩獨(dú)立組之間比較用t檢驗(yàn)；各組之間的發(fā)病率的比較用x2檢驗(yàn)。 結(jié)果 1.病理切片結(jié)果：Ⅰ組：心肌完好，無炎性細(xì)胞浸潤；Ⅱ組：心肌出現(xiàn)不同程度的病變，有多少不等的炎性細(xì)胞浸潤，心肌病變主要在接近心肌外膜處，在心

8、包處發(fā)現(xiàn)大量鈣化區(qū)，在心肌外膜處發(fā)現(xiàn)有心肌壞死區(qū)，但所有的心臟都沒有發(fā)現(xiàn)纖維增生；Ⅲ1組：心肌間質(zhì)處有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤，有的心臟也發(fā)現(xiàn)心包處有鈣化灶，但不是特別明顯，比Ⅱ組有所減輕；Ⅲ2組心肌間質(zhì)處也有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤，但在心包處沒有發(fā)現(xiàn)有鈣化區(qū)，而且炎癥表現(xiàn)比Ⅱ組減輕；Ⅳ組：病變心臟偶有發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞的浸潤，無心包處鈣化區(qū)；Ⅴ發(fā)現(xiàn)基本同Ⅳ組。 2.各組發(fā)病率統(tǒng)計(jì)：P＜0.05，差異有顯著性。

9、 3.脾臟、心臟、腎臟與體重比值：脾臟與體重之比差異有顯著性，P＜0.001；心臟與體重之比差異有顯著性，P＜0.05；腎臟與體重之比差異無顯著性，P＞0.05。14天和21天數(shù)值差異無顯著性。 4.血清TNF-α水平分析：各組的TNF-a水平差異有顯著性，P＜0.001，組與組比較發(fā)現(xiàn)： ①Ⅱ、Ⅲ1、Ⅲ2組與Ⅰ組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)； ②Ⅳ、Ⅴ組比Ⅰ組有所升高，但差異無顯著性(P＞0.0

10、5)； ③Ⅲ1和Ⅲ2組比Ⅱ組有所降低，但差異無顯著性； ④Ⅳ、Ⅴ組與Ⅱ組相比明顯降低，差異有顯著性(P＜0.001)； ⑤Ⅳ、Ⅴ組比Ⅲ1、Ⅲ2明顯降低，但兩組之間差異無顯著性； ⑥Ⅲ2組比Ⅲ1比較有所降低，但差異無顯著性； ⑦Ⅴ組比Ⅳ組有所降低，但差異無顯著性。 14天和21天數(shù)值差異無顯著性。 5.免疫熒光結(jié)果：Ⅰ組幾乎沒有發(fā)現(xiàn)熒光處；Ⅱ組可以看到比較粗的熒光條帶，主要集中在心肌

11、間質(zhì)，尤其在沿血管周圍比較集中，這與病理切片下炎癥細(xì)胞積聚的區(qū)域比較吻合；Ⅲ1、Ⅲ2組：與Ⅱ組比較，熒光的密度和強(qiáng)度有所降低；而Ⅳ、Ⅴ組的熒光條帶增寬，在心肌間質(zhì)組織中呈寬大的條索狀分布，亮度也增加許多。 6.電鏡觀察：Ⅰ組完全正常：肌絲排列整齊，無肌節(jié)斷裂，各細(xì)胞器都正常；Ⅱ組心肌肌絲排列紊亂，肌節(jié)斷裂嚴(yán)重，還發(fā)現(xiàn)線粒體肥大，并且出現(xiàn)空泡變性；Ⅲ1、Ⅲ2組這些病變有所減輕；Ⅳ組肌絲排列紊亂大大減輕，肌節(jié)斷裂比Ⅱ組減少，線粒體基