茶樹SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系的建立與應(yīng)用.pdf

1、茶樹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，栽培歷史悠久、分布廣泛，種質(zhì)資源極為豐富，但與其他重要經(jīng)濟(jì)作物相比，目前對(duì)茶樹遺傳基礎(chǔ)的研究相對(duì)缺乏，在此方面的知識(shí)積累相對(duì)薄弱，尤其是對(duì)SSR標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用更是鮮見報(bào)道。本研究利用現(xiàn)有生物數(shù)據(jù)庫(kù)中的茶樹EST資源，開發(fā)SSR引物，并建立SSR標(biāo)記技術(shù)體系，然后應(yīng)用于茶樹品種資源的遺傳多樣性分析。其主要結(jié)果如下： 采用改進(jìn)的DNA提取方法提取高質(zhì)量的茶樹基因組DNA，用已知濃度的lambda DNA

2、 standard對(duì)所提DNA進(jìn)行定量檢測(cè)，建立了一種新的測(cè)定茶樹基因組DNA濃度的方法。該法在國(guó)內(nèi)發(fā)表的文獻(xiàn)中還未見采用。 通過(guò)對(duì)茶樹SSR反應(yīng)體系各因素進(jìn)行優(yōu)化，建立最適的反應(yīng)條件為：反應(yīng)總體積20 μL，各成分的濃度或含量分別為1×Buffer，MgCl<,2>1.5～2.5 mmol/L，dNTPs0.2mmol/L、引物各0.25 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U，DNA模板用量30 ng。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?/p>

3、95℃ 5 min；95℃ 1min，各引物最佳溫度退火45 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。經(jīng)多次擴(kuò)增實(shí)踐證明，該技術(shù)體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。 利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)中的茶樹ESI序列，采用Primer3軟件設(shè)計(jì)了33對(duì)SSR引物，并利用外文文獻(xiàn)中發(fā)表的17對(duì)引物，共合成50對(duì)SSR引物對(duì)茶樹基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，有37對(duì)引物獲得了擴(kuò)增產(chǎn)物，其可擴(kuò)增率為74％。用37對(duì)可擴(kuò)增引物對(duì)43個(gè)茶樹品種(系

4、)擴(kuò)增，經(jīng)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，其中有34對(duì)引物產(chǎn)生多態(tài)性，不同引物擴(kuò)增帶數(shù)分布在1～11條之間，擴(kuò)增片段大小介于150～350 bp。 從34對(duì)可擴(kuò)增引物中選擇16對(duì)擴(kuò)增43個(gè)茶樹品種(系)，首次采用毛細(xì)管電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，共獲得142個(gè)等位變異。應(yīng)用DPS軟件，進(jìn)行遺傳距離和相似性系數(shù)計(jì)算，43份材料遺傳距離的變化范圍在0.059～0.820之間，說(shuō)明供試茶樹資源間的遺傳變異十分寬廣。根據(jù)UPGMA法構(gòu)建聚類樹

5、狀圖，在平均遺傳距離水平上，可將43份材料劃分為7個(gè)類群，大部分具有相近系譜的品種(系)被聚在一起?？梢姡琒SR分子標(biāo)記技術(shù)能較好地揭示品種資源問(wèn)的親緣關(guān)系。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠銀染技術(shù)和毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法對(duì)供試茶樹品種(系)不同引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，初步建立了43個(gè)供試材料在34個(gè)SSR位點(diǎn)的指紋，為構(gòu)建我國(guó)茶樹種質(zhì)的SSR基因型數(shù)據(jù)庫(kù)奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。 本文研究的開展，將加速茶樹EST資源的開發(fā)利用與SSR標(biāo)記技術(shù)在茶