靶向毒素DT-,389-—hbFGF的克隆表達(dá)及對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞毒性研究.pdf

1、　　本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)保留白喉毒素N端389個(gè)氨基酸的基因序列，即白喉毒素的毒性區(qū)和跨膜區(qū)，而用人18KDbFGF基因序列替代白喉毒素的細(xì)胞結(jié)合區(qū)序列構(gòu)建成pGEX-DT389-hbFGF嵌合毒素質(zhì)粒并原核表達(dá)、純化；10％SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色及Westernblot鑒定表達(dá)蛋白并通過Brandford染色法測(cè)定融合蛋白的濃度；MTT比色法測(cè)定免疫毒素不同劑量、不同作用時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞(HLECs)成

2、活率的影響及DT多抗對(duì)免疫毒素毒性作用的抑制；流氏細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量免疫毒素所致細(xì)胞死亡方式。結(jié)果如下：　　1.克隆獲得序列正確、包含DT毒性區(qū)及跨膜區(qū)基因序列的pGEM-DT389質(zhì)粒?！　?.以孕12周人胎腦皮質(zhì)為材料，較容易地獲得序列正確的18KDbFGF基因序列，為bFGF基因序列的獲得提供了一條便利途徑?！　?.克隆獲得序列正確的pGEX-DT389-hbFGF重組表達(dá)質(zhì)粒，其中包含DT毒性區(qū)、跨膜區(qū)、18KDbFGF三

3、段基因序列?！　?.通過控制誘導(dǎo)表達(dá)條件，使表達(dá)產(chǎn)物主要存在于上清中。純化后表達(dá)蛋白濃度約為0.47mg/ml?！　?.成功培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞并傳代用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)?！　?.MTT實(shí)驗(yàn)顯示重組免疫毒素DT389-hbFGF對(duì)體外培養(yǎng)HLECs有明顯毒性作用，且在一定范圍內(nèi)存在劑量、時(shí)間依賴性，半數(shù)致死量約3.8×10-11mol/L，DT多抗可明顯抑制免疫毒素的毒性作用?！　?.流氏細(xì)胞術(shù)證明不同劑量免疫毒素所致體外培養(yǎng)HLE