TrKB、VEGF在鼻咽癌中的表達及其調控腫瘤侵襲轉移的體內體外研究.pdf

1、第一部分 TrKB及VEGF在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義
　　 目的:
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是來源于鼻咽上皮組織的高度惡性腫瘤，其預后與腫瘤的局部復發(fā)、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關。有研究發(fā)現腫瘤血管形成與惡性腫瘤生長、侵襲轉移與及預后密切相關。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是人們發(fā)現的重要的血管生成

2、因子，通過促腫瘤血管生成而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。酪氨酸激酶B(Tyrosine kinase B，TrKB)在腫瘤血管生成及腫瘤生長，浸潤轉移及預后密切相關。本部分研究意在探討VEGF及TrKB在NPC組織中的表達并比較兩者表達的相關性及分析與腫瘤臨床特征的關系。
　　 方法:
　　 采用免疫組化方法檢測55例鼻咽癌組織和30例正常鼻咽組織中VEGF及TrKB蛋白表達水平，比較二者表達差異。根據患者年齡、腫瘤臨床

3、分型、原發(fā)灶大小、淋巴結轉移和有無遠處轉移將病例分組，應用雙變量相關pearson檢驗分析研究VEGF及TrKB表達與腫瘤臨床病理特征之間的關系
　　 結果:
　　 1.VEGF蛋白于腫瘤細胞漿及血管內皮細胞漿中均表達，TrKB蛋白陽性表達絕大多數位于細胞漿內。在55例鼻咽癌中，45例表達TrKB陽性，表達率為82.1％，47例表達VEGF陽性，表達率為85.7％。30例正常鼻咽組織中，只有3例表達TrKB陽性，5例表達

4、VEGF陽性，腫瘤組織中TrKB、VEGF陽性表達率明顯高于正常鼻咽組織(P＜0.05)，鼻咽癌組織中VEGF與TrKB表達有明顯相關性(相關系數R=0.586，P＜0.05)。
　　 2.VEGF蛋白表達與NPC的臨床分期(P=0.002)、腫瘤的直徑大小(P=0.009)及有無淋巴結轉移(P=0.001)明顯相關，與患者性別、年齡、有無遠處轉移無關(P＞0.05)。TrKB蛋白表達與臨床分期(P=0.00)、腫瘤的直徑大小(

5、P=0.00)、有無淋巴結轉移(P=0.006)明顯相關，與患者性別、年齡、有無遠處轉移無關(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1.VEGF，TrKB在NPC組織中表達增加，可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關;
　　 2.TrKB可能與鼻咽癌血管形成有關。
　　 第二部分阻斷BDNF-TrKB通路對鼻咽癌細胞腫瘤生物學行為影響的體外研究
　　 目的:
　　 探討通過酪氨酸激酶受體抑制劑K252

6、a抑制TrKB表達，觀察抑制TrKB表達對體外培養(yǎng)的鼻咽癌CNE-1細胞增殖、運動遷移、細胞周期、細胞凋亡及對VEGF表達的影響。
　　 方法:
　　 分別用不同濃度K252a干預鼻咽癌CNE-1細胞，MTT實驗比較不同濃度K252a對鼻咽癌CNE-1細胞生長的影響，并計算細胞生存(增殖)率，篩選出K252a最佳干預濃度;通過劃痕愈合試驗觀察抑制TrKB表達后對鼻咽癌CNE-1細胞運動遷移能力的影響;流式細胞術分析抑制T

7、rKB表達對鼻咽癌CNE-1細胞遷移、細胞周期和凋亡的影響。
　　 分別用RT-PCR、Western-blot檢測K252a干預鼻咽癌CNE-1細胞后VEGF、TrkB在mRNA以及蛋白層面表達的改變并與對照組比較差異。
　　 結果:
　　 MTT實驗:K252a能明顯抑制鼻咽癌CNE-1細胞的增殖，使細胞數量減少、密度減低、細胞生存率下降，其對鼻咽癌CNE-1細胞生長的抑制作用與K252a干預時間、濃度呈正相

8、關。K252a作用48h使鼻咽癌CNE-1細胞增殖率抑制最明顯的濃度為400 nmol/L，細胞生存減少50％(與對照組相比)，故選取此濃度為K252a最佳干預濃度。
　　 劃痕愈合實驗:抑制TrKB表達可使劃痕愈合延遲，使12h鼻咽癌CNE-1細胞遷移距離明顯小于對照組，但無明顯統(tǒng)計學差異(P=0.18)，使24h小時細胞遷移距離細胞遷移距離明顯少于對照組(P=0.013)，說明抑制TrKB表達能一定程度上抑制鼻咽癌CNE-1

9、細胞的運動遷移能力。
　　 流式細胞儀分析:K252a干預鼻咽癌CNE-1細胞的細胞周期分布，與對照組相比，鼻咽癌CNE-1細胞中處于G0/G1期的細胞顯著增多(57.67±7.03 vs73.86±4.22，P=0.018)，而處于S期(30.67±3.68 vs15.37±2.16，P=0.025)的細胞顯著減少，比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);流式細胞儀技術檢測K252a干預鼻咽癌CNE-1細胞后細胞凋亡情況，K252a

10、與對照組細胞的凋亡率比較有統(tǒng)計學意義(22.27±3.09 vs3.42±2.56,P=0.01)。
　　 Western blot:K252a干預鼻咽癌CNE-1細胞后，與對照組相比，VEGF蛋白表達水平下調(0.6883±0.19 vs0.378±0.44)，TrKB蛋白表達水平下調(0.631±0.15 vs0.313±0.28)，差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 RT-PCR:K252a干預鼻咽癌CNE

11、-1細胞后，與對照組相比，細胞內TrkB mRNA表達下調(0.67±0.37 vs0.435±0.63);VEGF mRNA表達下調(0.6883±0.49 vs0.425±0.17)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論
　　 1.TrKB表達抑制可降低鼻咽癌CNE-1細胞生長遷移能力;
　　 2.TrKB表達抑制可通過促進鼻咽癌CNE-1細胞凋亡、細胞周期改變和降低VEGF表達，從而減弱生長與遷移

12、能力;
　　 3.TrKB通過調控VEGF影響鼻咽癌血管形成。
　　 第三部分 TrKB調控鼻咽癌新生血管生成的體內研究
　　 目的:
　　 體內腫瘤生長依賴腫瘤血管生成。近年來發(fā)現VEGF通過誘導血管生成及促進血管內皮細胞分裂從而促進血管形成。研究證實血管生成、微血管與腫瘤侵襲轉移之間的關系密切，微血管密度(microvesseldensity，MVD)與腫瘤的轉移和預后有關，且VEGF表達與MVD的表

13、達有良好的相關性。前部分體外實驗研究已經發(fā)現K252a能抑制VEGF蛋白和基因水平的表達，本部分實驗通過建立裸小鼠移植瘤模型，探討K252a干預鼻咽癌CNE-1細胞對人鼻咽癌血管生成抑制作用的體內研究，為針對鼻咽癌抗血管生成基因治療尋找新的思路。
　　 方法:
　　 使用4-6周齡雄性BALB/C-nu/nu裸鼠，體重在16～20g，將人鼻咽癌CNE-1細胞于裸鼠右側季肋部皮下注射，建立荷人鼻咽癌細胞裸小鼠皮下移植瘤模型

14、。隨機將實驗動物分為2組，A組:K252a干預組，7只;B組:PBS組，7只;于接種腫瘤細胞后第6、8、10、12、14天用微量注射器于A組裸鼠腫瘤內多點注射K252a藥物，400nmol/L200ul/次，對兩組移植瘤模型進行為期21天的實驗觀察，自第一次注射藥物后每隔2天測量1次裸鼠腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。
　　 于接種后第21天處死，剝離腫瘤標本，測量最后體積，觀察標本整體特征。取出部分組織的標本于固定于10％福爾馬林

15、溶液中，于我院病理科常規(guī)石蠟包埋后行連續(xù)切片，進行常規(guī)HE染色、VEGF、TrKB和CD31相關抗原免疫組化染色。
　　 結果:
　　 1.中瘤標本大體形態(tài)及HE染色觀察:2組實驗動物成瘤均于接種后第4天。兩組腫瘤與周圍組織分界清楚，包膜基本完整。K252a干預組治療組皮下腫瘤瘤體較小，呈不規(guī)則球形，也有的呈分葉狀，表面灰白色，質地較硬。剖面呈白色，剖面滲血較少。對照組腫瘤瘤體較K252a組明顯增大，表面多不平，有分葉狀

16、結節(jié)狀，表面豐富血管形成，剖面滲血較多;
　　 2.實驗動物瘤體體積觀察: K252a干預組從給藥開始，腫瘤生長緩慢，第21天腫瘤瘤體體積為(328+326.7) mm3，同期對照組為(1044+818) mm3;
　　 3.兩組CD31標記的MVD計數與VEGF、TrKB染色評分對比及相關性分析
　　 K252a干預組和對照組陽性血管計數分別為22.39±4.72、49.79±11.12，方差分析各組間差別具有

17、顯著性(P＜0.05)。K252a干預組VEGF表達明顯比對照組下降，并有統(tǒng)計學差異(7.57+2.82 vs9.86±2.79，P=0.007)，K252a干預組明顯比對照組TrKB表達下降，并有統(tǒng)計學差異(5.8571±2.79 vs7.43±2.64，P=0.005)，各組VEGF表達與MVD明顯相關(對照組:r=0.88，P=0.009，K252a組:r=0.96，P=0.01)，MVD與TrKB表達明顯正相關(對照組:r=0.