芥藍黑芥子酶基因的克隆與原核表達.pdf

1、異硫氰酸鹽(Isothiocyanatcs，ITCs)中的蘿卜硫素是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最強抗癌成分。蘿卜硫素前體物質(zhì)4-甲基硫氧丁基硫苷的含量在蕓薹屬蔬菜中以芥藍中最高。異硫氰酸鹽以阻遏和抑制致癌因子而發(fā)揮抗癌作用。此外，異硫氰酸鹽還有抗菌、防腐和抵御植物病蟲害的能力。黑芥子酶(Myrosinase)是異硫氰酸鹽合成的關(guān)鍵酶，天然的異硫氰酸鹽是由黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)產(chǎn)生的。 本研究采用cDN

2、A末端快速擴增(Rapid Amplification ofcDNA Ends，RACE)技術(shù)，從芥藍幼嫩的葉片中分離克隆出黑芥子酶基因，對該基因進行序列分析和功能預(yù)測，并構(gòu)建了該基因的原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達，最后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測分析，結(jié)果表明該重組質(zhì)粒能在大腸桿菌中表達。具體結(jié)果如下： 1．克隆及序列分析：從芥藍葉片中提取總RNA，根據(jù)已報道的黑芥子酶核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計一對引物，利

3、用RT-PCR技術(shù)獲得771bp基因的保守序列，然后根據(jù)該保守序列設(shè)計特異引物，利用RACE技術(shù)獲得芥藍黑芥子酶cDNA全長序列(1807bp)，該序列包含完整的編碼序列(1647bp)，編碼548個氨基酸，命名為Myrshjg。該基因與歐洲油菜、菜心、大白菜、芥菜、蘿卜、、白芥、山葵的黑芥子酶的核苷酸同源性分別達到97％、97％、96％、92％、93％、91％和87％，氨基酸序列同源性分別為99％、98％、98％、93％、94％、90