白藜蘆醇降低長鏈非編碼RNAAK001796表達抑制惡性細胞生長.pdf

1、背景與目的：
　　長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA，其本身并不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達水平。越來越多的研究表明，lncRNA不僅參與物種進化、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝、基因組印記等，而且異常表達的lncRNA與人類疾病密切相關，尤其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。肺癌的發(fā)病率和死亡率位居全球居民癌癥的首位，在中國

2、等遠東國家肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，吸煙和二手煙暴露是其主要環(huán)境危險因素，并且約90％的肺癌發(fā)生與吸煙相關。作為多環(huán)芳(香)烴(polycyclic aromatic hydrocarbon)家族典型代表的苯并[a]芘（benzo(a)pyrene，B[a]P）是吸煙產(chǎn)生的主要的致癌物之一。苯并[a]芘經(jīng)過體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化形成的活性代謝產(chǎn)物反式-7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并芘（anti-benzo(a)pyrene-7,8-diol-

3、9,10-epoxide，anti-BPDE）已被證實具有強烈的致癌性，但對其致癌作用機制還不完全明了。白藜蘆醇（resveratrol）是一種由植物合成的對抗外來病原的多酚類化合物，廣泛存在于多種植物體內(nèi)，在癌癥的化學預防和治療中具有特殊的功能。已有研究表明 microRNA在白藜蘆醇的抗癌過程中發(fā)揮了重要作用，這為我們研究白藜蘆醇的抗癌作用機制提供了新的線索。本課題即是研究白藜蘆醇抗癌過程中異常表達的lncRNA在肺癌化學預防及治療

4、中的作用，揭示lncRNA在惡變的支氣管上皮細胞和肺癌細胞株中的功能。
　　方法：
　　1.白藜蘆醇對肺癌細胞及惡變的支氣管上皮細胞生長的影響以不同濃度的白藜蘆醇處理人肺癌細胞株A549細胞及aiti-BPDE誘導惡變的人支氣管上皮細胞，處理48 h后用CCK-8試劑和酶標儀檢測細胞的生長情況。檢測步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。
　　2.白藜蘆醇誘導lncRNA表達譜改變 A549細胞經(jīng)25μmol/L的白藜蘆醇處理48 h

5、后利用lncRNA基因芯片分析給予化學預防劑白藜蘆醇處理前后lncRNA表達譜的改變。
　　3. lncRNA表達水平的檢測用SYBR Green染料法對lncRNA進行qRT-PCR定量檢測。
　　4.瞬時轉(zhuǎn)染小分子干擾RNA（siRNA）利用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000將siRNA導入細胞，轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。待細胞轉(zhuǎn)染48 h后收獲細胞，提取細胞總RNA進行qRT-PCR定量檢測干擾效率。

6、　　5.細胞增殖實驗把待轉(zhuǎn)染細胞按3×103個/孔的密度接種于96孔板，24 h后分組進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，在酶標儀上用CCK-8試劑盒檢測每組細胞的增殖能力。檢測步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。
　　6.細胞周期檢測將待轉(zhuǎn)染細胞無血清培養(yǎng)24 h后，利用脂質(zhì)體Lipofectamine-2000將siRNA導入細胞，48h后消化收集細胞，經(jīng)PI染色后，用流式細胞儀進行細胞周期檢測。
　　7.細胞凋亡實驗細胞轉(zhuǎn)染48 h后，

7、用0.25%不含EDTA的胰酶消化液收獲細胞，用Annexin V-FITC試劑盒和流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　8. shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染利用脂質(zhì)體 Lipofectamine-2000將shRNA導入細胞，轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后，用400μg/ml的G418進行篩選，約2月后收獲細胞并提取細胞總RNA進行qRT-PCR定量檢測干擾效率。
　　9.軟瓊脂集落形成實驗每孔加2 ml0.3%低熔點瓊脂糖細胞

8、混合液（1000個cell/孔）于已鋪好含2 ml0.6%底層瓊脂的6孔板里，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，計數(shù)大于50個細胞的克隆。
　　10.裸鼠成瘤試驗將培養(yǎng)好的各轉(zhuǎn)染組細胞用胰酶消化收獲，離心后用PBS溶液重懸，計數(shù)細胞密度并調(diào)整各組細胞密度統(tǒng)一，在每只 BALB/c裸鼠的腹股溝皮下注射200μl約含4×106個細胞的細胞懸液。密切觀察成瘤情況，并每周測量腫瘤體積，4周后處死裸鼠，取出腫瘤測量并稱重。
　　11.統(tǒng)計分析采

9、用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以 sx±表示，所有試驗數(shù)據(jù)均至少3次重復。兩組間比較用雙側Student’s t-test；3組以上的比較采用單因素方差分析，所有檢驗均以雙側P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.白藜蘆醇抑制A549細胞及16HBE-T細胞的生長0-100μmol/L的白藜蘆醇處理A549細胞及16HBE-T細胞48 h后細胞增殖受到明顯抑制，并且呈現(xiàn)劑量依賴關系。
　　2

10、.白藜蘆醇處理前后lncRNA表達譜改變 A549細胞經(jīng)25μmol/L的白藜蘆醇處理48 h后進行l(wèi)ncRNA基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)21個lncRNA表達上調(diào)、19個lncRNA表達下調(diào)。選取下調(diào)表達最明顯的AK001796進一步研究其功能。
　　3. AK001796的表達水平檢測與DMSO溶劑對照組相比，25μmol/L白藜蘆醇處理48 h后的A549細胞、H446細胞和惡性轉(zhuǎn)化的16HBE-T細胞中AK001796的表達水平均

11、明顯下調(diào)。而與正常人支氣管上皮細胞16HBE和BEAS-2B細胞相比，A549細胞、H446細胞和16HBE-T細胞中AK001796明顯高表達。
　　4.轉(zhuǎn)染siRNA及shRNA后AK001796的表達變化 A549細胞、H446細胞和16HBE-T細胞轉(zhuǎn)染siRNA48 h后及shRNA篩選約2月后，AK001796的表達水平均明顯下調(diào)，選取干擾效果最佳的siRNA-3進行后續(xù)研究。
　　5.轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力改變轉(zhuǎn)染

12、48 h后，siRNA-3組處理的A549細胞（60.06±4.00）%及H446細胞（84.06±4.00）%和16HBE-T細胞（65.02±5.35）%的細胞活力顯著下降，與siRNA-NC組相比差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　6.轉(zhuǎn)染后細胞周期分布改變轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-3組處理的A549細胞和16HBE-T細胞的G2/M期和S期細胞比例明顯減少，而G0/G1期細胞比例則明顯增多，與siRNA-NC組相比

13、差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　7.轉(zhuǎn)染后細胞凋亡率檢測轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-3組處理的A549細胞和16HBE-T細胞的凋亡率與siRNA-NC組相比差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　8.軟瓊脂集落形成實驗 A549細胞shRNA轉(zhuǎn)染組集落形成率降低到（29.33±4.16），與shRNA-NC組（65.00±10.54）相比差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　9.裸鼠成瘤實驗 A549細

14、胞shRNA轉(zhuǎn)染組的腫瘤重量(80.20±42.08 mg)和腫瘤體積(152.54±57.37 mm3)均明顯低于 shRNA-NC組的重量(271.56±115.84 mg)和體積（455.01±214.03 mm3)，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：
　　1.在肺癌細胞株和惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細胞16HBE-T中AK001796均高表達，經(jīng)白藜蘆醇處理后均低表達。
　　2. AK001796表