Apigenin對人卵巢癌細胞系CAOV3的抑制作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、本研究通過觀察apigenin在阻滯細胞周期和誘導凋亡等抑制腫瘤細胞增殖方面的顯著藥理作用，為研究apigenin作為一種新的化療藥物提供理論依據(jù)。并且為進一步探討飲食結(jié)構(gòu)與卵巢癌的關(guān)系，以及通過選擇合理的飲食結(jié)構(gòu)，尋找切實可行的卵巢癌預防手段提供依據(jù)。 研究方法： 1、用倒置相差顯微鏡、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法和流式細胞術(shù)(flow cytometer，F(xiàn)CM

2、)法，觀察apigenin對CAOV3細胞增殖的影響。用倒置相差顯微鏡觀察10、20、40、80、160μMapigenin作用CAOV3細胞48h后，與對照組相比較，CAOV3細胞的形態(tài)變化。用MTT方法，分析10、20、40、80、160μM apigenin作用CAOV3細胞48h后，以及80μMapigenin作用CAOV3細胞24h，48h，72h后與對照組相比，CAOV3細胞的生長情況。用FCM方法，分析lO、20、40、8

3、0、160μM apigenin作用CAOV3細胞24h、48h后，CAOV3細胞周期的變化情況。 2、用免疫組織化學(streptavidin，SP)、逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot方法，分析apigenin對CAOV3細胞增殖抑制的作用機制。用SP方法觀察80gMapigenin作用CAOV3細胞72

4、h后與對照組相比，CAOV3細胞中survivin蛋白的表達。用RT-PCR方法分析10、20、40、80、160μMapigenin作用CAOV3細胞48h后，以及80μMapigenin作用CAOV3細胞24h，48h，72h后與對照組相比，apigenin對的CAOV3細胞中survivin、p21、caspase-3和VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄的影響。用Western blot方法分析apigenin對CAOV3細胞中survivin

5、、p21和caspase-3蛋白表達的影響。 3、用SP法和RT-PCR方法分析survivin和VEGF在卵巢癌和正常卵巢中的表達情況。用SP法分析38例卵巢癌組織和8例正常卵巢中survivin和VEGF蛋白的表達情況。用RT-PCR方法分析20例卵巢癌組織和4例正常卵巢中survivin和VEGFmRNA的表達情況。 4、統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包，計量資料用成組比較t檢驗，計

6、數(shù)資料用X<'2>檢驗，用Spearman和Pearson進行相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。 研究結(jié)果： 1、觀察apigenin對CAOV3細胞增殖的影響。10、20、40、80、160gM apigenin作用CAOV3細胞48h后與對照組相比，隨著藥物劑量的增加，實驗組形態(tài)不規(guī)則，細胞密度逐漸降低，細胞間隙逐漸增寬，細胞體積逐漸縮小，細胞內(nèi)顆粒逐漸增多。160μM時，可見大量壞死細胞碎片。對照組細胞形態(tài)規(guī)則，細胞

7、外觀呈長梭行，細胞膜完整，染色質(zhì)分布均勻。MTT結(jié)果：10、20、40、80、160μMapigenin抑制率分別為2.7％，9.0％，24.5％，42.8％，63.8％，隨著劑量增加抑制率逐漸增加(P<0.01)。并且80μMapigenin作用CAOV3細胞24h，48h，72h后，抑制率分別為13％，43％，68％，隨著時間延長抑制作用明顯增強(P<0.01)。隨著apigenin劑量的增加和作用時間的延長，CAOV3細胞的增殖抑

8、制越來越明顯，表現(xiàn)出良好的劑量依賴性和時間依賴性。FCM結(jié)果：10、20、40、80gMapigenin作用CAOV3細胞24h后，G2/M期細胞比例由6.45％逐漸升高到43.17％，G0/G1期與S期所占百分比逐漸減少，表現(xiàn)出G2/M期阻滯。Apigenin作用48h后，G2/M期細胞所占百分比由0.49％升到63.2％，G0/G1期與S期所占百分比明顯減少，G2/M期阻滯較24h更加明顯。并且80gMapigenin作用24、48

9、h均出現(xiàn)凋亡峰，即亞G1期細胞(凋亡細胞群)。 2、分析apigenin對CAOV3細胞增殖抑制的作用機制。免疫組化結(jié)果顯示：對照組CAOV3細胞的胞漿內(nèi)幾乎全部可見棕黃色顆粒，即survivin蛋白表達陽性。80gMapigenin作用CAOV3細胞72h后，survivin蛋白仍然表達，但是表達強度明顯下降。RT-PCR和Western Not結(jié)果顯示：隨著apigenin劑量的增加和作用時間的延長，CAOV3細胞中surv

10、ivinmRNA和蛋白、VEGFmRNA表達下調(diào)，但p21和caspase-3的mRNA和蛋白表達上調(diào)。 3、Survivin和VEGF在卵巢癌和正常卵巢中的表達情況。免疫組化結(jié)果顯示：survivin和VEGF在卵巢癌中均高表達。27例survivin陽性的卵巢癌病例中，19例VEGF呈陽性表達，二者共表達為50.00％。11例survivin陰性病例中8例VEGF呈陰性表達，同時不表達為21.05％。統(tǒng)計學分析表明，surv

11、ivin和VEGF的表達呈正相關(guān)(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：卵巢癌組織中survivin和VEGFmRNA的表達較正常卵巢明顯增高(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、Apigenin可以使卵巢癌細胞系CAOV3阻滯在細胞周期的G2/M期，并能誘導其凋亡，發(fā)揮其抑制CAOV3細胞增殖的作用，這種增殖抑制作用具有量效關(guān)系和時效關(guān)系。 2、Apigenin可以下調(diào)CAOV3細胞中survivin的表達，上調(diào)

12、p21和caspase-3的表達，推測apigenin抑制CAOV3細胞增殖的作用機制可能與survivin表達下調(diào)繼而引起的癌細胞周期阻滯和誘導凋亡相關(guān)。Apigenin除可以抑制CAOV3細胞增殖外，還可以下調(diào)CAOV3細胞中VEGFmRNA的表達，具有潛在的抗腫瘤血管生成的作用。提示其有望成為一種新的抗卵巢癌藥物。 3、人卵巢癌組織中survivin和VEGF的mRNA和蛋白均呈高表達，survivin與VEGF蛋白在卵巢