腹瀉仔豬Salmonella、Escherichia coli分離鑒定及生物膜與耐藥性和毒力關(guān)系研究.pdf

1、自2010年冬季以來，先后在我國包括安徽在內(nèi)的多個省份發(fā)生了大范圍的生豬腹瀉疫情，各種日齡的豬均有發(fā)生，其中以哺乳仔豬最為嚴重，表現(xiàn)為發(fā)病急、發(fā)病率和死亡率高的特點。根據(jù)全國豬病持續(xù)監(jiān)測和調(diào)查結(jié)果，當(dāng)前造成生豬腹瀉流行的主要病原是豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，除此之外尚與豬輪狀病毒、博卡病毒、豬圓環(huán)病毒、沙門氏菌、致病性大腸桿菌等病原的存在有關(guān)。沙門氏菌和致病性大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的主要細菌性病原菌。隨著獸醫(yī)臨床上抗生素的不合

2、理使用，致使沙門氏菌、大腸桿菌耐藥菌株的數(shù)量逐年上升，臨床用藥效果不明顯，而生物膜的形成則是細菌增強抵抗不良環(huán)境的結(jié)果，如對抗生素的敏感性、毒力的改變等。針對安徽地區(qū)的生豬腹瀉疫情，為制定有效的防控措施提供科學(xué)依據(jù)，我們分別從病毒性病原和細菌性病原兩個方面展開了調(diào)查研究。圍繞沙門氏菌和致病性大腸桿菌，本研究進行了以下工作：
　　1、采用常規(guī)法結(jié)合PCR技術(shù)，對601份糞便和腸道內(nèi)容物樣品進行沙門氏菌和致病性大腸桿菌的分離鑒定；并利

3、用玻片凝集試驗鑒定分離菌株的血清型。結(jié)果顯示，601份樣品中分離到沙門氏菌69株，陽性檢出率為11.5％，致病性大腸桿菌129株，陽性檢出率為21.5%。其中糞便樣品中沙門氏菌檢出率為13.1%，致病性大腸桿菌檢出率為7.5%；腸道內(nèi)容物樣品中沙門氏菌檢出率為8.8%，致病性大腸桿菌檢出率為44.7%。沙門氏菌血清型有德爾卑沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、明斯特沙門氏菌、紐蘭沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌，其優(yōu)勢血清型為德爾卑沙門

4、氏菌；致病性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型為O:55、O:26、O:125、O:128、O:6、O:111、O:15、O:7、O:104。
　　2、采用Kirby-Bauer紙片擴散法，對沙門氏菌和致病性大腸桿菌分離株進行23種抗生素敏感性實驗。結(jié)果顯示，69株沙門氏菌分離株對四環(huán)素和強力霉素的耐藥率高，分別為71.1%、69.6%，而對哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢哌酮、亞胺培南、頭孢曲松均敏感；分離株耐7-10種抗生素的菌株

5、占10.1%(7/69)，耐11種抗生素的菌株占4.3%(3/69)，多重耐藥譜為四環(huán)素-強力霉素-阿莫西林-氨芐西林-甲氧芐啶-復(fù)方新諾明-氟苯尼考。129株致病性大腸桿菌分離株對四環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林、強力霉素、復(fù)方新諾明、甲氧芐啶的耐藥率高，分別為92.2%、92.2%、93%、90.7%、89.1%、87.6%，而對亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、呋喃妥因、頭孢吡肟的敏感率最高，分別為98.4%、88.4%、88.4%、86.

6、8%。分離株耐2-10種抗生素的菌株占31.0%(40/129)，耐11-20種抗生素的菌株占66.7%(86/129)，耐21種抗生素的菌株占0.8%(1/129)，多重耐藥譜為阿莫西林-氨芐西林-四環(huán)素-強力霉素-復(fù)方新諾明-甲氧芐啶-慶大霉素-環(huán)丙沙星。同時結(jié)合表型確證試驗鑒定產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株，結(jié)果鑒定出沙門氏菌1株、致病性大腸桿菌38株。結(jié)果表明，沙門氏菌和致病性大腸桿菌均具有較強的多重耐藥性，且致病性大腸

7、桿菌強于沙門氏菌。
　　3、采用96孔板法測定沙門氏菌和致病性大腸桿菌分離株體外生物膜形成能力，將生物膜的形成能力分為強（3+）、中（2+）、弱（1+）和陰性（—）。結(jié)果顯示，沙門氏菌分離株生物膜陽性率為92.8%(64/69)，其中3+占14.5%(10/69)、1+占78.3%(54/69)；致病性大腸桿菌分離株生物膜陽性率為96.1%(124/129)，其中3+占14.7%(19/129)、2+占20.9%(27/129)、

8、1+占60.5%(78/129)。結(jié)果表明，沙門氏菌和致病性大腸桿菌分離株生物膜陽性率高，生物膜形成均以1+為主。
　　4、選擇生物膜形成強的沙門氏菌3株和致病性大腸桿菌2株，共5株。采用微孔板法測定5株細菌的浮游細菌及生物膜細菌對環(huán)丙沙星、氟苯尼考、強力霉素、頭孢拉定的最小抑菌濃度（MIC），同時測定不同時間點細菌形成生物膜能力及對應(yīng)時間點生物膜細菌的MIC。結(jié)果顯示，5株生物膜細菌對環(huán)丙沙星的MIC較浮游細菌提高2~16倍，對

9、氟苯尼考的MIC較浮游細菌提高8~16倍，而對強力霉素和頭孢拉定的MIC兩者則無差異。5株細菌在不同時間點形成生物膜的能力不同，生物膜形成3+時對環(huán)丙沙星、氟苯尼考的MIC最大。結(jié)果表明，5株細菌在形成生物膜后對環(huán)丙沙星、氟苯尼考的耐藥性增強。
　　5、選擇8株生物膜形成強3+（3株）、弱1+（3株）、陰性—（2株）的沙門氏菌和8株生物膜形成強3+（2株）、中2+（2株）、弱1+（2株）、陰性—（2株）的致病性大腸桿菌，采用寇氏改

10、良法測定對昆明小鼠的半數(shù)致死量（LD50），并利用SAS軟件對結(jié)果進行分析。結(jié)果顯示，沙門氏菌生物膜形成3+的LD50分別為2.44×109CFU/mL、8.75×106 CFU/mL、2.80×107 CFU/mL；1+的LD50分別為1.19×107 CFU/mL、1.85×107 CFU/mL、4.77×107 CFU/mL；—的LD50分別為1.50×107 CFU/mL、3.08×107 CFU/mL；致病性大腸桿菌生物膜形成

11、3+的LD50分別為9.59×108 CFU/mL、6.87×108 CFU/mL；2+的LD50分別為2.30×108 CFU/mL、4.64×108 CFU/mL；1+的LD50分別為3.34×107 CFU/mL、7.32×107 CFU/mL；—的LD50分別為1.20×107 CFU/mL、2.75×107 CFU/mL。沙門氏菌生物膜形成3+與1+、—細菌毒力差異顯著（P<0.05）；致病性大腸桿菌生物膜形成3+與1+、—細