家蠅抗菌肽cecropin基因在原核細(xì)胞中的高效融合表達(dá)及抑制性消減文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、家蠅天蠶素(Mdmcec)分子量約為4.0 kDa，由31～39個(gè)氨基酸殘基組成，對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)病毒、真菌也有一定的抑制作用，有望發(fā)展為新一代肽類(lèi)抗生素。本論文以家蠅為實(shí)驗(yàn)材料，以Mdmcec為基礎(chǔ)，對(duì)其抗血清的制備、體外高效表達(dá)進(jìn)行了較詳盡的研究，并對(duì)家蠅體內(nèi)的免疫和發(fā)育相關(guān)因子進(jìn)行了差異篩選。 為增強(qiáng)Mdmcec的抗原性，利用同尾酶技術(shù)構(gòu)建了Mdmcec六拷貝首尾串聯(lián)的融合表達(dá)載體pQEMdmc

2、ec6，并在大腸桿菌M15中得到高效表達(dá)，包涵體蛋白經(jīng)尿素變性后，利用鎳螯和層析純化了串聯(lián)體蛋白，純化量為30mg/l。將純化蛋白免疫新西蘭大白兔，成功制備了Mdmcec6串聯(lián)體抗血清(命名為： anti-Mdmcec6)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗6His-Mdmcec6的滴度高達(dá)1∶12400，抗Mdmcec的效價(jià)為1∶5000。Western blot分析表明，制備的抗血清不僅能特異性地識(shí)別純化的Mdmcec，而且能特異性地識(shí)別家蠅

3、蛋白粗提液中的cecropin。 為了高效表達(dá)可溶性的Mdmcec，本研究利用基因工程手段，構(gòu)建了家蠅抗菌肽cecropin基因與硫氧還蛋白(Trx)融合的表達(dá)質(zhì)粒pTRX-Mdmcec，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得高效、可溶性表達(dá)。融合蛋白經(jīng)鎳螯和層析一步純化，純化的融合蛋白經(jīng)腸激酶切割后，釋放出具有殺菌活性的Mdmcec。重組Mdmcec經(jīng)鎳螯和層析和RP-HPLC得到純化，純化量為111.2 mg/l。Western

4、 blot檢測(cè)表明，Mdmcec能被anti-Mdmcec6抗體特異性地識(shí)別。電噴物質(zhì)譜(ESI-MS)分析表明，Mdmcec的分子量為4.0 kDa。圓二色譜(CD)分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)中不含β-sheet結(jié)構(gòu)，由61﹪a-helix和39﹪的Random組成。液相法測(cè)定Mdmcec抑菌活性表明，Mdmcec不僅對(duì)革蘭氏陰性菌E. coli K<,12>D<,31>和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus有很

5、強(qiáng)的抑菌活性，而且對(duì)一些真菌也有很強(qiáng)的抑制作用，且對(duì)鼠血細(xì)胞無(wú)溶血作用。雜合肽CA-MA(家蠅cecropinA(1-8)和非洲爪蟾magainin2(1-12))具有廣譜的抗菌活性。為了廉價(jià)生產(chǎn)家蠅抗菌肽cecropin和CA-MA，本實(shí)驗(yàn)將Mdmcec和CA-MA與家蠅泛素(ubiquitin)融合，構(gòu)建了能表達(dá)天然N末端蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pQEUBIMdmcec和pQEUBICAMA，并在宿主菌M15中得到高效表達(dá)，表達(dá)量分別為4

6、7 mg/l和36 mg/l的融合蛋白。 為了給泛素融合蛋白的切割提供高活性的泛素C末端水解酶，并便于純化切割后釋放出的抗菌肽。本實(shí)驗(yàn)將果蠅泛素水解酶(FUCH)插入到畢赤酵母載體pPICZaA，在酵母細(xì)胞GS115中高效表達(dá)了C端帶有6His純化標(biāo)簽的FUCH，F(xiàn)UCH經(jīng)鎳螯和層析得到簡(jiǎn)易純化，純化量為19 mg/l。 Tricine-SDS-PAGE和活性測(cè)定表明，融合蛋白經(jīng)FUCH切割后，釋放出具有殺菌活性的抗菌肽

7、Mdmcec和CA-MA，且分子量與預(yù)期大小一致。Mdmcec和CA-MA經(jīng)鎳螯和層析、超濾和RP-HPLC得到進(jìn)一步的純化后，獲得重組蛋白分別為8.4 mg/l和6.8 mg/l。激光飛行質(zhì)譜(MADU-TOF-MS)分析表明，MdmceC和CA-MA分子量分別為4032 Da和2559Da。圓二色譜(CD)分析CA-MA二級(jí)結(jié)構(gòu)表明，CA-MA在水相中的二級(jí)結(jié)構(gòu)不含β-sheet結(jié)構(gòu)，由17.4﹪a-helix和82.6﹪的Rand

8、om組成?；钚詼y(cè)定表明重組蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌、陽(yáng)性菌和真菌有很強(qiáng)的抑制作用，而且對(duì)小鼠血細(xì)胞無(wú)溶血作用。 為了尋找家蠅免疫調(diào)控相關(guān)因子和發(fā)育調(diào)控基因，本研究以健康家蠅三齡幼蟲(chóng)為對(duì)照群體，以細(xì)菌誘導(dǎo)后的三齡幼蟲(chóng)和蛹為目標(biāo)群體，構(gòu)建了抑制性差減文庫(kù)(SSH)。對(duì)PCR篩選的部分克隆子測(cè)序，獲得了359條ESTs。將ESTs進(jìn)行同源性分析，獲得了143條不同ESTs，可初步分為六類(lèi)，第一類(lèi)：13條免疫相關(guān)ESTs；第二類(lèi)：18個(gè)轉(zhuǎn)錄因

9、子相關(guān)ESTs；第三類(lèi)：61條酶類(lèi)相關(guān)的ESTs：第四類(lèi)：25條受體相關(guān)ESTs；第五類(lèi)：14條ESTs，其中包括發(fā)育相關(guān)、細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)、細(xì)胞骨架和功能未知的ESTs；第六類(lèi)：家蠅已經(jīng)在GenBank登錄的12條ESTs?？傊?，本論文首次成功制備了Mdmcec抗血清，為抗菌肽抗血清的制備提供了新的思路，并為抗菌肽cecropin在蛋白水平上的檢測(cè)提供了分子依據(jù)；抗菌肽的體外成功的高效融合表達(dá)為抗菌肽的功能與結(jié)構(gòu)研究及其應(yīng)用提供了經(jīng)濟(jì)的表