家蠅幼蟲抗菌肽Defensin基因的克隆、表達(dá)與活性初步研究.pdf

1、廣東醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文家蠅幼蟲抗菌肽Defensin基因的克隆、表達(dá)與活性初步研究姓名：許琴英申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學(xué)指導(dǎo)教師：朱家勇20050501家蠅幼蟲抗菌肽D e f e n s i n 基因的克隆表達(dá)與活性初步研究摘 要【目的】昆蟲防御素( I n s e c t D e f e n s i n s ) 是昆蟲體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類陽離子肽，對細(xì)菌、真菌等微生物具有廣譜的殺傷作用，是目前生命科學(xué)研究的一個熱點(diǎn)。天

2、然昆蟲防御素來源有限，很難滿足科研和應(yīng)用的需要，采用傳統(tǒng)方法大量制備很困難，而人工合成成本高，因此通過基因工程途徑大規(guī)模生產(chǎn)防御素是一種理想途徑。本論文運(yùn)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，在對家蠅幼蟲D e f e n s i n 基因進(jìn)行克隆分析的基礎(chǔ)上，采用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)對目的基因進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析分離純化后，以大腸桿菌為受試對象，對目的蛋白的抑菌活性進(jìn)行初步研究?！痉椒ā縧 ，D e f e n s i n ：基因的克隆

3、分析用大腸桿菌( E s c h e r i c h i a , c o l i ) 和金黃色葡萄球菌( S t a p , b y f 0 C 0 ( - C U Sa u r e u s ) 免疫家蠅t ( m u s c a d o m e s t i c a ) 三_ 蛉幼蟲，4 8 h 后采用T R I z o H 試劑提取總R N A 。根據(jù)G e n B a n k 上公布的家蠅成蟲防御素基因，利用P r i m e rP

4、 r e m i e r 5 ．0 生物學(xué)軟件設(shè)計～對特異性引物進(jìn)行R T - P C R 。P C R I 產(chǎn)物克隆至t i p U C m - T 載體上，酶切和P C R J 鑒定后測序，運(yùn)用生物信息學(xué)對目的基因進(jìn)行序列分析并預(yù)測其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)。2 ．D e f e n s i n 基因的原核表達(dá)及活性鑒定采用克隆技術(shù)，構(gòu)建D e f e n s i n g [ ] 的原核表達(dá)載體，獲得融合組氨酸( 6 ×H

5、 i s )標(biāo)簽的重組質(zhì)粕：p E T 3 0 a ( + ) ／D e f e n s i n 和融合谷胱甘肽( G S T ) 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒p G E X ．- 4 T - 1 ／D e f e n s i n 。轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)過程中對I P T G濃度、誘導(dǎo)溫度和時間進(jìn)行優(yōu)化。采用親和層析法分離純化融合蛋白，S D S ．．P A G E和W e s t e m b l o t t i n g 鑒定目的蛋