中國明對蝦絲氨酸蛋白酶基因的研究.pdf

1、中國明對蝦是我國重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在沿海地區(qū)海產(chǎn)品養(yǎng)殖中占有重要的經(jīng)濟地位。然而，自上世紀90年代以來，對蝦疾病頻繁爆發(fā)，使海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大損失。解決這一問題除環(huán)境因素外，提高對蝦自身免疫力和抗病力是一個很重要的方面。因此只有了解了對蝦的免疫機制才能為其疾病控制提供有效的方法。 在無脊椎動物中，絲氨酸蛋白酶調(diào)控多種防御反應(yīng)，包括血淋巴凝結(jié)、抗菌肽合成和在病原體表面形成黑化包囊。這些過程都需要血淋巴中的絲氨酸蛋白酶的參與，當受

2、到病原體的感染，絲氨酸蛋白酶可以迅速激活免疫應(yīng)答途徑。 本論文以中國明對蝦絲氨酸蛋白酶這個與對蝦先天免疫相關(guān)的基因為研究對象，應(yīng)用一系列的生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，進行基因克隆、組織分布以及表達研究，試圖從一定層面上了解對蝦的免疫機制，為對蝦疾病的防治提供理論依據(jù)。 1、首次克隆得到了中國明對蝦絲氨酸蛋白酶全長基因。 利用同源克隆的方法，從中國明對蝦血細胞中克隆得到了中國明對蝦絲氨酸蛋白酶全長cDNA，全長106

3、5bp，開放閱讀框(ORF)為1020bp，編碼339個氨基酸，由信號肽、一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(Clip domam)和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Tryp_SPc domam)構(gòu)成。 2、應(yīng)用RT-PCR，Northem Blot和原位雜交方法，對中國明對蝦絲氨酸蛋白酶在中國明對蝦中的表達和分布進行了研究。 RT-PCR和Northerm Blot結(jié)果顯示，中國明對蝦絲氨酸蛋白酶在對蝦的血細胞和鰓中發(fā)生轉(zhuǎn)錄，而在其它組

4、織中無表達，并且結(jié)果還顯示，在細菌刺激的中國明對蝦血細胞中和鰓中，絲氨酸蛋白酶基因表達下調(diào)。推測該基因可能與免疫防御有關(guān)。 原位雜交結(jié)果顯示，絲氨酸蛋白酶基因只在血細胞中表達，在中國明對蝦鰓中的陽性信號也是源自血細胞。 3、中國明對蝦絲氨酸蛋白酶原核表達研究。本文構(gòu)建了中國明對蝦絲氨酸蛋白酶表達載體sp-pET-30a(+)，并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功表達了目的蛋白，并應(yīng)用親和層析的方法純化到了高純度的重