體細(xì)胞克隆牛TTF-1的表達(dá)及甲基化研究.pdf

1、自1997年以來，多種動(dòng)物相繼克隆成功。但克隆效率低下和克隆動(dòng)物的發(fā)育缺陷，限制了體細(xì)胞克隆技術(shù)的應(yīng)用。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(Thyroid transcription factor 1，TTF-1)是一種同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，屬于NKX2家族成員，它在甲狀腺、肺和前腦中表達(dá)，并調(diào)控組織特異性基因的表達(dá)：它在肺的發(fā)育和維持成體肺功能中扮演重要角色。研究TTF-1基因在克隆牛和正常牛中的表達(dá)差異和甲基化狀態(tài)，對(duì)揭示克隆牛肺發(fā)育缺陷的機(jī)理有重要意

2、義。 本研究首先利用RT-PCR、反向PCR和兼并引物PCR等方法，擴(kuò)增得到牛的TTF-1序列；分別提取4頭克隆牛(9C1、9C3、9C4和9C8).和2頭對(duì)照牛(9N1和9N4)的肺組織總RNA，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了TTF-1在克隆牛和正常牛肺組織中的表達(dá)水平；對(duì)該基因5’端進(jìn)行了甲基化分析。主要結(jié)果如下： 1．分離并鑒定了牛TTF-12499bp的序列，包括第一外顯子上游序列135bp、第一外顯子77bp，第

3、一內(nèi)含子709bp、第二外顯子373bp、第二內(nèi)含子932bp和部分外顯子三273bp。 2．克隆牛9C1、9C3、9C4和9C8的TTF-1mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為7.95、0.81、2.94和1.53，對(duì)照牛9N1、9N4分別為6.66和4.43。各個(gè)樣品間TTF-1的表達(dá)量均達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)。 3．對(duì)克隆牛9C3和對(duì)照牛9N1啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行甲基化分析，所有甲基化分析的序列位于內(nèi)含子1內(nèi)，共長約800b

4、p。分三段序列對(duì)其分析：分別命名為CpG1、CpG2和CpG3。CpG1長410bp，含有24個(gè)CpG位點(diǎn)；CpG2長305bp，含11個(gè)CpG位點(diǎn)；CpG3長248bp，含15個(gè)CpG位點(diǎn)。50個(gè)CpG位點(diǎn)在克隆牛9C3和對(duì)照牛9N1啟動(dòng)子區(qū)均處于去甲基化狀態(tài)。 4．克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N1、9N4翻譯起始位點(diǎn)上游序列比對(duì)結(jié)果有以下不同：在第二外顯子上游-881位點(diǎn)處克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N1為A，而對(duì)照牛9

5、N4為G：-741位點(diǎn)處克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N1為C，而對(duì)照牛9N4為A；-595位點(diǎn)處克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N1為C，而對(duì)照牛9N4為T：-551位點(diǎn)處克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N4為C，而對(duì)照牛9N1為T；-471位點(diǎn)處克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N1為A，而對(duì)照牛9N4為T；-311位點(diǎn)處克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N1為G，而對(duì)照牛9N4為A：-281位點(diǎn)處克隆牛9C3、9C8和對(duì)照牛9N1為T，而對(duì)照