SiRNA下調bFGF基因對肺腺癌A549影響的相關性研究.pdf

1、目的與背景:肺癌是世界上最常見的癌癥，肺癌可分為兩大類:非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)，NSCLC(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的80％～85％，非小細胞肺癌已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌病死率無論男女均占惡性腫瘤病死率的第一位，嚴重威脅人類健康。近年來，隨著分子生物學和藥理學的不斷發(fā)展，NSCLC的綜合治療及個體化治療已取得明顯進步，然而由于腫瘤耐藥

2、的出現，使得絕大部分腫瘤化療后很快出現復發(fā)或或轉移，從而限制了許多化療藥物例如紫杉醇等抗腫瘤藥物在NSCLC治療的臨床應用。
　　 bFGF在體內分布非常廣泛，其生物學行為呈多樣性和多效性分布。bFGF主要存在低親和力受體和親和力受體兩類，分別為肝素受體和酪氨酸蛋白激酶受體;不同組織細胞FGF受體表達特異性。目前研究證實在腫瘤細胞的生長、生存、凋亡和在新生血管的FGFs-FGFRs信號通路的異?；罨嘘P聯并參與其過程。研究表明，

3、肺癌患者bFGF血清含量和患者預后密切相關，血清含量高者預后較差。過往研究發(fā)現bFGF參與病理和生理的新生血管的機制相關，推測bFGF不僅在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移過程中發(fā)揮著重要作用，還有機體的耐藥性有關。構建靶向bFGF的siRNA，以脂質體為載體介導bFGF siRNA轉染肺腺癌細胞株A549，利用實時熒光定量逆轉錄一聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reacti，R

4、T-PCR)檢測bFGF siRNA干擾下調前后細胞內bFGF的mRNA含量，篩選轉染下調最顯著的siRNA序列;利用蛋白質免疫印跡檢測技術(western blot analysis，Western blot)檢測bFGF siRNA干擾下調前后肺腺癌A549細胞內bFGF蛋白水平變化。應用MTT法即標準比色法檢測bFGF siRNA干擾下調前后腫瘤細胞內bFGF的表達水平與紫杉醇藥物敏感性的關系，為臨床個體化治療提供理論依據。

5、>　　 方法:應用PUBMED查尋bFGF基因序列，NM_002006.4，采用人工合成siRNA序列，同時以negative siRNA作為對照，能夠用脂質體Lipofectamine2000為載體將bFGF siRNA導入肺腺癌A549細胞進行瞬時轉染，對bFGF siRNA干擾下調前后肺腺癌A549細胞提取總RNA及總蛋白，應用RT-PCR技術對siRNA干擾下調前后肺腺癌A549細胞的bFGF mRNA進行定量分析，篩選出轉染

6、效率高的siRNA序列。再利用篩選的siRNA序列干擾下調肺腺癌A549細胞，步驟同前，Westen-blot法檢測干擾下調后肺腺癌A549細胞中bFGF蛋白水平的表達。MTT比色法檢測干擾下調前后肺腺癌A549細胞對紫杉醇藥物敏感性的變化。應用流式細胞儀檢測干擾下調后肺腺癌A549細胞凋亡和細胞周期的變化。
　　 結果:RT-PCR結果顯示bFGF siRNA干擾下調后肺腺癌A549后bFGF基因水平表達降低，其中bFGF s

7、iRNA-2基因序列轉染下調效率最高;Western blot檢測結果顯示siRNA-1干擾下調肺腺癌A549細胞后其bFGF蛋白表達水平較干擾下調前顯著降低。MTT比色法檢測干擾下調前后肺腺癌A549細胞對紫杉醇藥物敏感性，結果顯示干擾下調前后細胞對紫杉醇的抑制率較對照組顯著增高(P＜0.05)。流式細胞儀細胞凋亡檢測顯示:bFGF siRNA+紫杉醇組凋亡細胞比例較controlsiRNA組、control siRNA+紫杉醇組、b