Cap43在肺癌血清中的表達及干擾mTOR信號途徑調控Cap43基因在肺癌中表達機制的研究.pdf

1、目的:
　　 鈣激活蛋白43(calcium activated protein43,Cap43)基因又名N-myc下游調控基因-1(N-myc downstreamraguglatedgene1,NDRGl),是美國紐約大學MaxCostA研究組ZhouD與SalnikowK于1998年在研究鎳化合物致癌機理中發(fā)現的人類新基因,其mRNA大小為3000bp,編碼394個氨基酸殘基,相對分子質量為43000。Cap43基因,由鎳

2、化合物特異性誘導,其蛋白表達于胞漿,具有鎳特異性結合位點片斷。Cap43基因表達水平的高低與鎳化合物作用的時間及作用劑量的強度有時間劑量上的依賴性。Cap43基因在鎳化合物所誘導的肺癌細胞系中轉錄、表達水平超過正常細胞30倍,其mRNA非常穩(wěn)定,并且為肺癌發(fā)生、發(fā)展的早期事件之一;Cap43蛋白在肺癌細胞或組織中呈高度穩(wěn)定表達,而在正常細胞或組織中不表達或呈極低表達。
　　 PI3K/Akt/mTOR是與細胞增殖和細胞凋亡關系最

3、密切的信號傳導通路之一,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。干擾PI3K-Akt-mTOR信號傳導途徑可以影響腫瘤細胞的轉移和浸潤,這一途徑中的任一關鍵分子都可以作為潛在的治療靶點。PI3K(磷脂酰肌醇-3羥基激酶pho-phati-dylinositol3kinase)是一個酯酶,其上游存在著RTKs(受體酪氨酸激酶,receptortyrosinekinase)/Ras(大鼠肉瘤,ratsarcoma,原癌基因C-ras的表達產物)信號

4、通路,當細胞受生長因子等刺激因子刺激后,細胞內PI3K活化,進而磷酸化其底物PIP2(3,4二磷酸磷脂酰肌醇,phosphatidylino-sitol-3,4-biphosphate),使其轉化為PIP3(3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇,phosphati-dylinositlo3,4,5-trisphosphate),并可活化下游Akt。Akt(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,protein-serine-threonine),又稱PKB(蛋白

5、激酶B,proteinkinaseB),通過血小板-白細胞C激酶同源區(qū)和PIP3結合,并通過PDK1、PDK2(磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶,phosphoinositide-Dependent-proteinkinase,PDK)使第308位上的蘇氨酸位點(Thr308)和第473位上的絲氨酸位點(Ser473)磷酸化而被激活?；罨腜I3K/Akt可能是通過TSC1/TSC2復合物(tuberoussclerosiscomplex,TS

6、C)進一步激活其下游分子mTOR。mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶向基因,mammaliantargetofrapamycin)又稱FRAP(FK506-bindingprotein12andrapamycinassociatedprotein),是一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶,由于其羧基末端與PI3K催化區(qū)高度同源,mTOR被認為是PI3K相關的蛋白激酶家族成員。mTOR可隨后磷酸化它的兩個下游分子,即翻譯抑制分子eIF-4E(真核翻譯

7、起始因子4E,eukaryotictranslationinitiationfactor4E)結合蛋白1(4E-BP1)和p70S6K磷酸化后激活其功能,同樣促進蛋白質的合成。因此,PI3K/Akt/mTOR被認為是蛋白質合成的主要信號調節(jié)通路,參與細胞增殖、分化、遷移等的調節(jié)。亦有研究結果顯示,PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路可能參與對HIF-1(缺氧誘導因子,hypoxiainduciblefactor-1)表達和活性的調控,

8、但在不同的細胞類型以及不同的實驗條件下又存在一定的差異。如果抑制mTOR的功能,理論上應該消除PI3K/Akt通路介導的增殖信號,使細胞周期阻滯,抑制腫瘤生長;針對鎳特異誘導Cap43高表中HIF-1所起的作用,如果抑制mTOR的功能,將使HIF-1表達下降,因而Cap43表達也應下降或極低表達。
　　 RNA干擾(RNAinterference,RNAi)也稱轉錄后基因靜默(posttran-scriptionalgenesi

9、lencing,PTGS),是由雙鏈RNA誘導的、能在細胞內有效地抑制有互補序列內源性基因的現象。它主要通過21-23nt的雙鏈或發(fā)夾狀RNA與特異性mRNA的結合導致靶基因的降解,進而導致目的蛋白表達下調。目前在研究哺乳動物細胞的基因功能方面,所產生RNAi效應主要應用兩條途徑:一是通過體外轉錄或化學合成小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)介導RNAi作用;二是通過短發(fā)央式RNA(shorthair

10、pinRNA,shRNA)表達載體轉染細胞后所表達的shRNA誘導RNAi作用?；瘜W合成的siRNA抑制作用時間短,成本昂貴,并且易被RNA酶污染降解;而shRNA表達載體轉染細胞后所表達shRNA成本較低,可在細胞內RNA酶的作用下被切割成與體外合成的siRNA相同的序列與結構,誘導RNAi。同時,由于它可自身復制,所以它可以穩(wěn)定持續(xù)地表達,使RNAi作用時間更長、更穩(wěn)定。慢病毒載體是一種復制缺陷型逆轉錄病毒載體,用慢病毒載體介導RN

11、Ai作用持久,并可以擴大載體感染細胞的范圍,因此近年來慢病毒載體作為基因治療載體被廣泛應用。顯然,用shRNA技術敲低mTOR的表達,比用對mTOR有較強特異性抑制作用的Rapamycin、CCI-779和RAD001等藥物抑制mTOR的表達更有安全性和科研意義。
　　 由于,鎳致癌以致肺癌為主,為此我們首先建立了一種雙抗夾心ELISA方法;并應用S-P(鏈霉素生物素蛋白.過氧化物酶連結法,streptavidin-perosi

12、dase)染色技術,檢測非接觸鎳的肺癌患者血清以及相應的腫瘤組織中Cap43的表達狀況,分析不同病理類型肺癌組織中Cap43蛋白的分布特征;分析擴大樣本以后的前項試驗結果的穩(wěn)定性和Cap43蛋白表達與腫瘤病理類型和分期的關系;運用shRNA表達載體轉染細胞的方法對PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑進行干擾,從而檢測mTOR敲減的靶細胞中Cap43表達情況及mTOR敲減的靶細胞的增殖活性和細胞數量的變化;分析shRNA干擾mTOR途徑

13、阻礙Cap43生成與鎳化合物的關系。本研究將為評價Cap43作為肺腺癌腫瘤標志物的可行性及作用機制,進一步完善PI3K/Akt/mTOR細胞信號傳導通路提供科學依據。
　　 方法:
　　 1、雙抗夾心ELISA方法對91例患者血清中Cap43的表達狀況進行初步定性檢測;采用S-P染色技術對91例不同組織學類型的肺癌石蠟組織標本中Cap43蛋白表達狀況及分布特征進行檢測;分析Cap43蛋白表達與病理分期的關系。
　　

14、 2、利用RNAi技術,設計合成針對mTOR基因的shRNA,逆轉錄病毒構建shRNA表達的慢病毒載體。RealtimeRT-PCR及WesternBlot篩選有效抑制mTOR的靶點,提取穩(wěn)定表達的細胞株,實驗驗證mTORshRNA干擾作用的特異性。
　　 3、實驗隨機分為單純人肺腺癌細胞A549組、人肺腺癌細胞A549+鎳轉化+rapamycin(mTOR抑制劑)組、人肺腺癌細胞A549+鎳轉化組、人肺腺癌細胞A549+鎳轉

15、化+shRNA干擾mTOR組。MTT法檢測各組細胞的增殖情況,流式細胞儀測定細胞的周期,AnnexinV/PI法檢測細胞的凋亡情況。RealtimeRT-PCR法分析各組細胞中Cap43mRNA和mTORmRNA的表達情況;WesternBlot法分析Cap43和mTOR蛋白的表達情況。
　　 4、統(tǒng)計學分析:實驗數據以均值±標準差表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包,各組之間的差異性比較應用單因素方差分析進行檢驗,用Spear

16、man和Pearson進行相關性分析,P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、ELISA檢測陽性率為80.22%,敏感度(SE)為84.51%,特異度(SP)為35.00%,陽性預測值(PV+)為82.19%,陰性預測值(PV-)為38.89%,實驗結果與病理診斷的符合率為73.63%。經X2檢驗得兩種檢驗方法無明顯差異。
　　 2、免疫組化方法發(fā)現Cap43陽性細胞主要分布于肺腺癌腫瘤細胞浸潤區(qū)

17、,陽性顆粒定位于腫瘤細胞的胞核/胞內;Cap43陽性細胞也同樣分布于肺鱗癌腫瘤細胞浸潤區(qū),陽性顆粒定位于腫瘤細胞的胞漿/胞內。
　　 3、realtimePCR回復驗證分析結果顯示,未感染慢病毒的細胞空白對照mTORmRNA的相對表達水平高于針對目的基因的RNAi靶點慢病毒感染組;陰性對照病毒感染的細胞組mTORmRNA的相對表達水平也高于針對目的基因的RNAi靶點慢病毒感染組。WesternBlot實驗結果顯示,陰性對照病毒感

18、染的細胞組mTOR蛋白的表達水平高于針對目的基因的RNAi靶點慢病毒感染組的蛋白表達水平。
　　 4、10mg/L濃度組對A549細胞的抑制率達50.62%,各刺激因素組細胞的抑制率與單純A549組比較,差異均顯著。流式細胞儀檢測結果顯示,與單純A549組相比,鎳轉化組Go/G1期細胞增加,S期細胞比例減少;鎳轉化+雷帕霉素組、鎳轉化+shRNA干擾mTOR組也出現Go/G1期細胞增加,S期細胞比例減少,發(fā)生了G1/S期細胞周期

19、阻滯,且與單純A549組相比差異顯著。不同刺激因素組細胞的凋亡率與單純A549細胞組相比較,也均具有顯著差異;鎳轉化+雷帕霉素組、鎳轉化+shRNA干擾mTOR組與鎳轉化組比較,均有統(tǒng)計學差異。
　　 5、realtimePCR和Westernblot分析顯示,Cap43的表達水平,鎳轉化組均高于單純A549組和鎳轉化+雷帕霉素組、鎳轉化+shRNA干擾mTOR組。mTOR的蛋白表達水平,鎳轉化組高于單純.A549組,差異顯著;

20、鎳轉化+雷帕霉素組和鎳轉化+shRNA干擾mTOR組均低于單純A549組和鎳轉化組,差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:
　　 1、肺腺癌Cap43含量與肺鱗癌Cap43含量均與分化程度相關,即分化程度越低,Cap43含量越高;肺腺癌與肺鱗癌Cap43陽性細胞主要分布于腫瘤細胞浸潤區(qū),肺腺癌陽性顆粒主要定位于腫瘤細胞的胞核;肺鱗癌陽性顆粒主要定位于腫瘤細胞的胞漿;兩者作用機制可能不同;
　　 2、從puromyci

21、n篩選觀察結果可見:目的細胞的感染效率達到80%以上;Realtime-PCR結果顯示:A549細胞中,針對目的基因的RNAi靶點慢病毒感染組對mTOR基因的敲減效率達到70%,WesternBlot結果顯示,針對目的基因的RNAi靶點慢病毒感染組靶點對A549細胞mTOR的表達有敲減效果;
　　 3、shRNA干擾組細胞的增殖作用明顯被抑制;干擾mTOR信號通路可以影響細胞進入DNA復制期;mTOR的活性被抑制會誘導細胞發(fā)生凋