Osteopontin在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡過程中表達(dá)的變化及其意義.pdf

1、目的：用“坐骨神經(jīng)撕脫法”建立“脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡”的動(dòng)物模型，檢測(cè)損傷前后Osteopontin(OPN)mRNA在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的表達(dá)變化，探討OPNmRNA在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡中的作用。 材料與方法：1.大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡模型的建立所有實(shí)驗(yàn)用鼠均為八周齡雄性Wistar鼠(均重200g，共30只)。用改良的Martin法制作坐骨神經(jīng)椎管外撕脫導(dǎo)致脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡的模型。先利用1.4％氟烷及1.5L/min氧氣對(duì)動(dòng)物

2、行吸入麻醉，于左側(cè)骨盆的外側(cè)和后肢的上部作正中切口，鈍性分離股二頭肌和臀肌，顯露坐骨神經(jīng)，然后逆尋至骨盆深部，椎管外。用小血管鉗將坐骨神經(jīng)從椎間孔拉出，使其與脊髓分離。放松肌肉，關(guān)閉切口。 2.組織標(biāo)本采集分別于術(shù)后1、3、7、14或21天處死動(dòng)物。在戊巴比妥麻醉下，通過灌注泵用冷生理鹽水及4％的低溫多聚甲醛(溶于pH=7.4的PBS中)對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行心內(nèi)灌注。收集含有L3、L4脊髓的組織塊，于固定液中4℃過夜固定，然后低溫保護(hù)于

3、含20％蔗糖的PBS溶液中過夜。用恒溫切片機(jī)切取12-μm的切片并放置于多聚賴氨酸包埋的載玻片上。 3.Nissl染色利用甲酚紫對(duì)切片進(jìn)行染色。 4.原位雜交 5.原位雜交與熒光免疫組化雙染色原位雜交反應(yīng)后，PBS清洗切片5min，然后與一抗在4℃下反應(yīng)過夜。一抗為單克隆小鼠抗NeuN抗體。切片用PBS沖洗三次以上，每次10min。最后與Alexa熒光488共軛的羊抗小鼠IgG抗體反應(yīng)并用熒光固定劑固定于載玻片上

4、。 6.免疫組化如文獻(xiàn)所述進(jìn)行免疫組化反應(yīng)。一抗是鼠抗神經(jīng)細(xì)胞核抗體。 7.細(xì)胞計(jì)數(shù)(NeuN陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞及表達(dá)OPN的細(xì)胞)隨機(jī)從切片中同側(cè)及對(duì)側(cè)的脊髓前角選取0.147mm2大小的范圍，計(jì)數(shù)NeuN和OPN陽(yáng)性的細(xì)胞。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用方差分析評(píng)估組間差異，并用Fisher最小顯著差值(LSD)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。P值小于0.05，有顯著意義。 結(jié)果：1.坐骨神經(jīng)撕脫傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的減少坐骨神經(jīng)撕脫傷

5、可造成脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的逐漸減少。從傷后第3天起，同側(cè)(損傷側(cè))前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目開始明顯減少，而同期對(duì)側(cè)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的減少則不明顯。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的減少隨時(shí)間顯著增加，在傷后第21天時(shí)，傷側(cè)已有50％以上的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元降解，傷側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量為對(duì)側(cè)的45％。坐骨神經(jīng)撕脫后，類似的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元減少的情況在過去的文獻(xiàn)中也有報(bào)道。 2.撕脫傷組和對(duì)照組中OPN陽(yáng)性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞情況利用原位雜交方法檢測(cè)坐骨神經(jīng)撕脫后OPNmRNA表達(dá)的時(shí)

6、間改變。通過形態(tài)學(xué)觀察，在正常對(duì)照組中，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)觀察到OPNmRNA的微弱表達(dá)。損傷后第3天，在傷側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞中的雜交信號(hào)水平升高。第21天時(shí)，OPNmRNA的表達(dá)恢復(fù)到正常水平。結(jié)合NeuN的熒光免疫組化及OPN的原位雜交兩種方法，OPN在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的表達(dá)得到進(jìn)一步的證實(shí)。 3.損傷后OPN陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞的定量分析我們比較損傷后第3天，在損傷側(cè)及對(duì)側(cè)的前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(NeuN陽(yáng)性)，表達(dá)OPN的細(xì)胞數(shù)量。雖然