PRP誘導人BMSc體內成骨及免疫配型不相合人BMSc混合培養(yǎng)實驗研究.pdf

1、由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等疾病引起的骨缺損是骨科臨床的常見病，骨缺損治療的難題主要是移植骨的來源問題。組織工程的興起和發(fā)展為骨缺損的修復開辟了一條新的途徑。骨組織工程技術以體外構建、體內重組的模式給這一領域提供了嶄新的治療技術手段，成為目前修復骨缺損的較為理想的方法。 [目的] 1.研究富血小板血漿對誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞生物學特性的影響，探討一種新的人骨髓基質干細胞培養(yǎng)方法，以滿足細胞培養(yǎng)過程中對各類細胞因子的需求，同時

2、盡量減少細胞培養(yǎng)過程中異源性抗原物質的引入，達到組織工程骨臨床應用中細胞數量與生物學特性的要求。 2.研究YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料對富血小板血漿誘導培養(yǎng)人骨髓基質干細胞成骨特性的影響，探討誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞與珊瑚羥基磷灰石材料的生物相容性，以確立組織工程骨臨床應用中所需的安全、有效的支架材料。 3.研究YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料與富血小板血漿誘導培養(yǎng)人骨髓基質干細胞在體內的成骨特性，并進行相關安全性檢測

3、，探討采用誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞與珊瑚羥基磷灰石材料體內異位成骨的方法及臨床應用的可行性。 4.探討組織配型不相合人骨髓基質干細胞(hBMSc)經混合與誘導培養(yǎng)后細胞的生長情況，初步探討異體骨髓基質干細胞作為骨組織工程種子細胞應用的可能性及建立“通用型”骨髓基質干細胞庫的可行性。 [方法] 1.12名患有骨折需行手術取自體髂骨移植的志愿者，排除其他系統(tǒng)疾病并簽署同意。男性8名，女性4名，平均年齡27.5歲。

4、 2.富血小板血漿(PRP)的獲取：將抽取的自體外周靜脈血200ml，加抗凝劑混勻，兩次離心。第一次在20℃，3600r/min離心10min。取上清及分界面下3mm部分置于另-離心管中，第2次在20℃，3600r離心15分鐘。棄上層3/4，剩余部分在漩渦振蕩器上輕振蕩使混勻，即為富血小板血漿。將富血小板血漿與催化劑溶液(含100g/L氯化鈣、400IU/ml凝血酶)以體積比9∶1混合，混勻后以0.22μm濾膜過濾即為富血小板血漿

5、復合因子萃取液。 3.人骨髓基質干細胞的獲取與培養(yǎng)：12名志愿者隨即分為兩組，每組6人。實驗組志愿者需提前提取自體的富血小板血漿并作好標記。無菌條件下抽取骨髓5ml。密度梯度離心法獲取有核細胞，接種于10cm2培養(yǎng)瓶。實驗組采用培養(yǎng)基為細胞來源個體的自體10％富血小板血漿配比高糖DMEM培養(yǎng)基加青霉素、鏈霉素各100μ/ml；對照組采用培養(yǎng)基為10％胎牛血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基加青霉素、鏈霉素各100μ/ml。置于37℃，5％

6、CO2孵育箱中，相差顯微鏡觀察細胞生長情況。原代培養(yǎng)9天后，胰蛋白酶消化并進行傳代誘導培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)采用50ug/ml抗壞血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘汕磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基，根據分組不同配比10％自體富血小板血漿或10％胎牛血清。通過相差顯微鏡、掃描電鏡及特殊染色的方法對比觀察實驗組與對照組細胞的生長情況與形態(tài)學變化；采用MTT法及堿性磷酸酶活性與細胞骨鈣素含量測定對比兩組的細胞增值情況與生物學特性。

7、 4.人骨髓基質干細胞與YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料復合：采用上述以自體富血小板血漿誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞(細胞的獲取、分離、原代培養(yǎng)及傳代誘導培養(yǎng)方法同上)。細胞培養(yǎng)至第3代，消化并收集細胞。將北京意華健公司的YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料切割成0.5×1×1cm大小塊狀并進行滅菌處理后，以種植密度為5×106將誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞與珊瑚羥基磷灰石材料復合培養(yǎng)。以人骨髓基質干細胞在相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)而不與材料復合作為

8、對照，通過相差顯微鏡、掃描電鏡對比觀察實驗組與對照組細胞的生長情況與形態(tài)學變化；采用MTT法對比兩組的細胞增值情況；采用考馬斯亮藍法測定細胞微量蛋白及堿性磷酸酶活性測定判定北京意華健公司的YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料對富血小板血漿誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞的生物學特性的影響。 5.富血小板血漿誘導培養(yǎng)人骨髓基質干細胞體內成骨：以自體富血小板血漿誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞(細胞的獲取、分離、原代培養(yǎng)及傳代誘導培養(yǎng)方法同上)。細胞

9、培養(yǎng)至第3代，消化并收集細胞。將北京意華健公司的YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料切割成0.5×1×1cm大小塊狀并進行滅菌處理后，以種植密度為5×106將誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞與珊瑚羥基磷灰石材料復合培養(yǎng)。14只裸鼠隨機分為兩組，實驗組將人骨髓基質干細胞與珊瑚羥基磷灰石材料復合培養(yǎng)3天后的復合物手術植入裸鼠肌袋內；對照組只采用珊瑚羥基磷灰石材料手術植入裸鼠肌袋內。分別與4、8、12周對裸鼠進行大體觀察、X線觀察并按照分組情況分批次處死

10、裸鼠，取組織切片并HE染色觀察成骨情況。 6.組織配型不相和人骨髓基質干細胞混合培養(yǎng)：12名志愿者根據組織配型情況將配型不相和志愿者配對，共配成6對。采用上述方法分別抽取骨髓，細胞的獲取、分離及原代培養(yǎng)方法同上，只是原代培養(yǎng)采用10％AB型血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基。傳代培養(yǎng)按照1∶2傳代，根據配對情況分別采用混合培養(yǎng)與混合誘導培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)組繼續(xù)采用10％AB型血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)；混合誘導培養(yǎng)組采用含10％A

11、B血清配比高糖DMEM培養(yǎng)基并添加50ug/ml抗壞血酸、10-8mol/L地塞米松、10-3mol/Lβ-甘油磷酸鈉進行誘導培養(yǎng)。采用倒置相差顯微鏡及MTT法對比研究兩組細胞與單個人骨髓基質干細胞培養(yǎng)的細胞形態(tài)、生長情況及增值等生物學特性。 [結果] 1.人骨髓基質干細胞培養(yǎng)結果：采用富血小板血漿與采用胎牛血清誘導培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞形態(tài)學相差不明顯。BMSc接種后12～24h開始貼壁，細胞貼壁后逐漸變形呈多角形、梭

12、型。6～8天后，細胞可長滿瓶底并呈現(xiàn)單層細胞融合。傳代培養(yǎng)后細胞生長迅速，接種細胞2～4天可長滿瓶底。細胞為長梭型或不規(guī)則多邊形，并由偽足伸出，胞核位于細胞一端。第3代細胞培養(yǎng)融合后，繼續(xù)培養(yǎng)至形成密集的細胞團簇，中心出現(xiàn)細胞基質的沉積，硒素紅染色可以清晰的顯示鈣結節(jié)；堿性磷酸酶染色可見胞質內有大量灰黑色顆粒或塊狀沉淀，呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽性。細胞生長至第8代生長明顯變緩，10代以后細胞內開始出現(xiàn)顆粒樣沉淀物，并由細胞脫落飄浮于液體中。

13、掃描電鏡觀察，黏附細胞為梭型或多角形表現(xiàn)，并有多個突起呈不規(guī)則形狀。誘導培養(yǎng)3d可測得堿性磷酸酶(ALP)活性及細胞骨鈣素含量，隨著誘導培養(yǎng)與培養(yǎng)時間的延長，ALP活性與骨鈣素含量增加。 2.北京意華健公司YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料：多孔，孔隙相通，孔徑范圍280～370μm，平均325μm。與材料復合培養(yǎng)的人骨髓基質干細胞復合后，12～24h可見到細胞開始與材料黏附，并開始伸出偽足成多角形附著于材料表面，在孔隙內沿材料的壁

14、貼附，有多個突起，沿展性好。隨時間延長材料表面黏附細胞增多，材料周邊細胞增殖速度及形態(tài)未受到明顯影響。細胞微量蛋白含量與堿性磷酸酶測定顯示單純細胞培養(yǎng)組與細胞材料復合培養(yǎng)組人骨髓基質干細胞的細胞微量蛋白含量無明顯差異，且均隨時間的延長而含量增加。 3.體外誘導培養(yǎng)人骨髓基質干細胞與珊瑚羥基磷灰石復合植入裸鼠肌袋術后4周，可見珊瑚羥基磷灰石表面有細胞生長，珊瑚羥基磷灰石孔隙內有結締組織長入；X線檢查可見少量照射遮擋，組織學觀察可將

15、少量骨形成。術后8周，珊瑚羥基磷灰石表面可見新生骨形成，孔隙內和孔隙邊緣可見骨樣組織沉積和少量軟骨樣組織形成；X線檢查可見明顯照射遮擋。術后12周，珊瑚羥基磷灰石材料表面可見有較多成熟編制骨形成，部分區(qū)域可見髓腔樣結構形成，并有血管長入。 4.混合培養(yǎng)組與單個培養(yǎng)組細胞生長情況無明顯差別，生長迅速，接種細胞2～3d可長滿瓶底。細胞呈梭形、多角形，胞漿淡藍色，核卵圓形，可見數個深藍色的核仁?；旌险T導培養(yǎng)組24h內細胞能較快的擴增，

16、細胞形態(tài)與混合培養(yǎng)組差異不明顯；48h后細胞大量凋亡，細胞數量明顯減少，72h后細胞減少殆盡，培養(yǎng)瓶內很難見到正常生長的細胞，僅存的細胞形態(tài)皺縮，趨于細胞凋亡形態(tài)。 [結論] 1.自體富血小板血漿能有效的促進人骨髓基質干細胞的增殖及分化，促進人骨髓基質干細胞成骨特性的表達；自體富血小板血漿替代動物血清誘導培養(yǎng)人骨髓基質干細胞可作為骨組織工程臨床應用的細胞誘導培養(yǎng)方法。 2.珊瑚羥基磷灰石材料對富血小板血漿誘導培養(yǎng)

17、人骨髓基質干細胞生長增殖及成骨特性無明顯影響；YHJ500珊瑚羥基磷灰石材料與人骨髓基質干細胞具有良好的生物相容性，其生物學特性基本符合骨組織工程的要求，可用于進一步骨組織工程相關研究。 3.富血小板血漿誘導培養(yǎng)人骨髓基質干細胞與北京意華健公司的珊瑚羥基磷灰石材料在裸鼠體內能夠良好的成骨，隨時間的延長，成骨特性越明顯；(2)體內采用肌袋包裹的方法能有效的增加血運及促進組織工程骨血管化的生成，促進成骨；本實驗所采用的富血小板血漿誘