mir-216a對胃癌細胞SGC7901生物學行為的影響及其相關機制.pdf

1、目的:
　　 1.檢測miR-216a在胃癌細胞SGC7901中的表達水平,建立microRNA的檢測方法。
　　 2.構建has-mir-216a真核表達載體,實現(xiàn)其在胃癌細胞SGC7901中有效表達,為進一步研究mir-216a的功能打下基礎。
　　 3.觀察mir-216導入對SGC7901細胞生物學行為的影響并探討其相關機制。
　　 方法:
　　 1.RT-PCR及Real-time PC

2、R檢測mir-216a在胃癌細胞SGC7901中的表達水平。
　　 2.依據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫中pre-mir-216a序列,設計引物；PCR擴增pre-mir-216a基因并將其克隆至PGH載體,產(chǎn)生PGH-pre-mir-216a重組質粒,酶切及測序驗證；將pre-mir-216a基因克隆至pGenesil-1載體,產(chǎn)生pgenesil-1-has-mir-216a重組質粒,HindⅢ酶切,測序驗證；脂質體法將pGenes

3、il-1-has-mir-216a載體及隨機片段HK的真核表達載體pGenesil-1／HK轉染入SGC7901細胞。轉染后24小時熒光顯微鏡下觀察轉染效率,轉染后48小時RT-PCR及Real-time PCR法檢測成熟mir-216a在SGC7901細胞中的表達。
　　 3.采用MTT法和細胞周期測定分析mir-216a對SGC7901細胞增殖的影響；采用MTT法檢測轉染前后阿霉素(ADR)對SGC7901細胞IC50值的變

4、化:采用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot法檢測轉染前后YB-1mRNA及蛋白的表達變化；采用Real-time PCR及FCM檢測轉染前后MDR1mRNA及細胞膜P-gp表達的變化。
　　 結果:
　　 1.miR-216a在SGC7901中表達水平較低,建立起microRNA的檢測方法。
　　 2.將pre-mir-216a基因克隆至PGH載體,重組質粒酶切及測序驗證顯示,pr

5、e-mir-216a基因序列與the miRNA Registry的序列一致；將pre-mir-216a基因克隆至pGenesil-1載體,酶切及測序鑒定顯示與理論完全一致,成功構建has-mir-216a真核表達載體；脂質體法將pgenesil-1-has-mir-216a載體轉染入SGC7901細胞,獲三組細胞,依次為SGC／mir-216a、SGC／HK及SGC7901組。熒光顯微鏡下觀察轉染效率約60％；RT-PCR結果顯示陽性

6、轉染組成熟mir-216a表達量明顯高于隨機片段組及空白對照組,三組細胞以U6標化后的mir-216a灰度值分別為0.761,0.238,0.156；real-time PCR法結果顯示陽性轉染組mir-216a表達水平較隨機片段組提高約32倍。
　　 3.生長曲線提示陽性轉染組細胞生長較對照組快,細胞周期動力學分析示陽性轉染組G1期細胞顯著減少,G2期與S期細胞顯著增多,提示mir-216a的導入可能促進胃癌細胞的增殖；MTT

7、法結果顯示陽性轉染組細胞的阿霉素IC50明顯高于隨機片段組和空白對照組,提示mir-216a可能參與了胃癌細胞對化療藥物ADM敏感性的調(diào)節(jié)；Real-time PCR顯示陽性轉染組MDR1mRNA較對照組提高2.75±0.10倍,流式細胞術檢測結果顯示,陽性轉染組p-gp表達上調(diào),熒光強度較對照組明顯增加,說明mir-216a的導入可能調(diào)節(jié)MDR1的轉錄及翻譯；RT-PCR顯示陽性轉染組YB-1 mRNA灰度值明顯增加,Real-tim

8、ePCR顯示陽性轉染組YB-1 mRNA較對照組上調(diào)3.27±0.10倍,Western blot結果顯示陽性轉染組YB-1蛋白條帶豐度明顯增加,說明mir-216a的導入可能促進YB-1的轉錄及翻譯。
　　 結論:1.mir-216a在SGC7901細胞中表達較低,成功建立microRNA的檢測方法。2.成功構建has-mir-216a真核表達載體,并實現(xiàn)其在胃癌細胞SGC7901中有效表達。3.mir-216a導入SGC79

9、01細胞能通過促進細胞周期由G1期向S期及G2期轉換而促進細胞增殖,并能降低細胞對化療藥物ADM的敏感性；轉染mir-216a導入SGC7901細胞能上調(diào)SGC7901細胞內(nèi)MDR1、p-gp及YB-1 mRNA、蛋白的表達。綜上所述,mir-216a可能通過轉錄及翻譯水平上調(diào)YB-1的表達,進而促進MDR1 mRNA及p-gp的表達,從而降低胃癌細胞對化療藥物ADM的敏感性。靶向mir-216a有望成為逆轉胃癌多藥耐藥的一條新的策略。